Protein Repair Strategies for the Functional Restoration of CARASIL-relevant HTRA1 Mutants
HTRA1, a trimeric serine protease implicated in both cellular signal transduction and protein quality control, belongs to the homo-oligomeric High Temperature Requirement A protease family, whose activation requires a conserved cascade of inter-protomer communication. Among other HTRA1 mutations amino acid substitutions within its trimer interface have been associated with CARASIL (Cerebral Autosomal Recessive Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leucoencephalopathy), a monogenic small vessel disease, that manifests with stroke, dementia, spondylosis deformans and alopecia at an early age of onset. The localization of these mutations as well as the detailed biochemical characterization presented in this study reveal that the associated loss of function phenotype is based on severe oligomerization defects causing a shift of the monomer-trimer equilibrium towards the monomeric state. Based on this finding a portfolio of protein repair strategies allowing for the functional restoration of the mutants' proteolytic activities was developed. A first approach focuses on the stabilization of inter-protomer contacts via supramolecular guanidinio carbonyle pyrrole (GCP)-clamps, which introduce a synthetic bridge across the inter-protomer gap thus compensating the loss of intrinsic affinity induced by the disease causing mutations. Assessing the compounds' effects via biochemical assays revealed that the GCP-clamps indeed induced a substantial increase in the interface-mutants' proteolytic activities that was associated with a distinct shift of the monomer-trimer equilibrium towards the trimeric form. A second repair strategy strives to exploit the activating features of regulatory peptides in order to artificially enhance the proteolytic activity of disease-relevant HTRA1 mutants. Testing a collection of peptidic ligands derived from our laboratory portfolio of HTRA1-activating sequences revealed that peptides derived from the C-termini of the mitochondrial channel proteins VDAC2 and VDAC3 were able to increase the proteolytic activity of wildtype HTRA1 as well as the monomeric CARASIL mutants via a novel mechanism that appeared independent of both the PDZ domain and the conserved inter-protomer activation cascade. This unusual mode of activity enhancement not only points to a potential route for therapeutic intervention, but also greatly expands our knowledge regarding HTRA1 activity regulation from PDZdependent modulation via the conserved activation cascade to processes, that are confined to a single protease domain hence abolishing the need for inter-protomer communication. Whereas the above strategies focus on the chemical modulation of proteolytic activity, an additional biologic approach developed by the group of Martin Dichgans (University Clinic Munich) centers on protein-based complementation of the CARASIL-associated trimer assembly defects via genetically engineered, inactive HTRA1 constructs carrying compensatory mutations. This study reports the determination of a crystal structure for HTRA1 comprising both a disease-relevant and the corresponding compensatory mutation thus shedding light onto the mechanisms underlying this third protein repair strategy. Taken together, the results presented in this study constitute a diverse repertoire of proof of concept approaches for the functional restoration of disease-relevant HTRA1 interface mutations. On a conceptual level these approaches should be widely applicable to a vast number of biological problems involving the modulation of proteinprotein interactions.
HTRA1, eine homo-trimere Serinprotease, die sowohl in der Protein-Qualitätskontrolle, als auch in der Weiterleitung zellulärer Signale eine Rolle spielt, gehört zur High Temperature Requirement A Familie, welche sich durch eine konservierte, Trimerabhängigige Aktivierungskaskade auszeichnet. Neben anderen HTRA1 Mutationen sind auch Aminosäure-Substitutionen im Trimer-Interface mit der Entstehung von CARASIL (Cerebral Autosomal Recessive Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leucoencephalopathy) assoziiert - einer monogenetischen Erkrankung, die mit frühzeitigen Schlaganfällen, Demenz, Spondylose und Alopezie einhergeht. Sowohl die Lokalisation der Mutationen, als auch ihre detailierte biochemische Analyse zeigen, dass der Loss-of-Function-Phänotyp auf schwerwiegenden Oligomerisierungsdefekten basiert, die eine Verschiebung des Monomer-TrimerGleichgewichtes hin zur monomeren Form bewirken. Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte ein Portfolio von Protein-Reparatur-Strategien entwickelt werden, die eine funktionelle Wiederherstellung der proteolytischen Aktivität der Mutanten bewirken. Ein erster Ansatz konzentriert sich auf die Stabilisierung von Inter-Protomer-Kontakten mittels supramolekularer Guanidiniocarbonylpyrrol (GCP)-"Klammern", die eine synthetische Brücke über den Inter-Protomer-Spalt bilden und so den durch die Mutationen hervorgerufenen intrinsischen Affinitätsverlust kompensieren. Biochemische Analysen ergaben, dass die GCP-Liganden eine Erhöhung der Aktivität der Interface-Mutanten bewirkten, die an eine deutliche Verschiebung des MonomerTrimer-Gleichgewichtes hin zum Trimer gekoppelt war. Eine zweite Reparatur-Strategie nutzt die aktivierenden Eigenschaften regulatorischer Peptide um die proteolytische Aktivität Krankheits-relevanter HTRA1-Mutanten artifiziell zu verstärken. Biochemische Tests ergaben, dass Peptide, die sich von den C-Termini der mitochondrialen Kanalproteine VDAC2 und VDAC3 ableiten, in der Lage sind sowohl die proteolytische Aktivität von Wildtyp-HTRA1, als auch die der monomeren CARASIL-Mutanten unabhängig von der PDZ-Domäne und der konserviereten Inter-Protomer-Aktivierungskaskade zu erhöhen. Dieser ungewöhnliche Mechanismus deutet nicht nur auf eine potentielle therapeutische Interventionsmöglichkeit hin, sondern erweitert auch unser Wissen über die HTRA1-Aktivitätsregulation von der bereits bekannten PDZ-abhängigen Modulation über die konservierte Aktivierungskaskade hin zu Prozessen, die innerhalb einer einzelnen Protease-Domäne und somit unabhängig von der Inter-Protomer Kommunikationskaskade ablaufen. Während die oben genannten Strategien sich mit der chemischen Modulation der HTRA1-Aktivität befassen, zielt ein weiterer durch die Arbeitsgruppe von Martin Dichgans (Klinikum der Universität München) entwickelter Ansatz auf die biologische, Protein-basierte Komplementation CARASIL-assoziierter TrimerAssemblierungsdefekte mittels genetisch modifizierter, inaktiver HTRA1-Konstrukte ab, welche kompensatorische Mutationen tragen. Diese Arbeit zeigt eine HTRA1- Kristallstruktur, die sowohl eine Krankheits-relevante, als auch die entsprechende kompensatorische Mutation beinhaltet, und gibt somit Aufschluss über die Mechanismen, die dieser dritten Reparatur-Strategie zugrundeliegen. Zusammengefasst erzeugen die in dieser Arbeit präsentierten Daten eine vielfältige Sammlung von Ansätzen zur funktionellen Restaurierung Krankheits-relevanter HTRA1 Interface-Mutationen. Auf konzeptioneller Ebene sollten diese Strategien zudem weitgehend übertragbar auf eine Vielzahl biologischer Fragestellungen sein, die die Modulation von Protein-Protein-Kontakten beinhalten.