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Global chromatin changes induced by altered tonicity interferes with DNA damage response signaling and DNA double-strand break repair

Krieger, Lisa Marie

The results of our experiments reveal that global changes in chromatin structure achieved by hypotonic or hypertonic treatment have severe consequences on DDR signaling and DSB repair and thereby endanger genomic stability. Chromatin relaxation by itself results in transient arrest of cells in G2-phase, which might be due to ATM activation. However, in response to IR DDR signaling is reduced in terms of pATM, γH2AX and 53BP1 foci formation. Surprisingly, we still see a strong G2-checkpoint response upon DSB induction, which is dependent on ATR as well as on ATM. Further investigation of upstream signaling of ATM will help to understand these diverse responses mediated by ATM. Since we observe functional DNA end resection in globally relaxed chromatin, an ATR mediated checkpoint response is promoted. However, DSB repair by the main repair pathways is disturbed, as we see less cNHEJ and especially HRR. Also altEJ fails to backup cNHEJ and HRR, but SSA is three-fold increased upon hypotonic treatment. As this is seen in experiments utilizing reporter cell lines, it would be interesting to investigate the response of SSA to chromatin relaxation on IR-induced DSBs. While impairments of faithful DSB repair are seen and in addition only mutagenic DSB repair is functional, the modest effects found in survival are unexpected. However, as continuous hypotonic treatment is toxic to the cells, the adaptation of the protocol to transient treatment explains the small radiosensitizing effect observed. DDR signaling experiments and also measurements of CCP show that effects of global chromatin relaxation mediated by hypotonic treatment are completely reversible. Global chromatin condensation achieved by hypertonic treatment arrests cells in G1-, G2- and M-phase, while it enhances DDR signaling in terms of ATM activation and H2AX phosphorylation in response to IR. However, DSB repair efficiency of all investigated repair pathways is compromised (cNHEJ) or completely abrogated (HRR, altEJ and SSA). This might be explained by nonfunctional DNA end resection upon chromatin condensation, which is necessary for HRR, altEJ and SSA. However, activation of checkpoints may help to maintain genomic stability although DSB repair is inhibited. Chromatin condensation and also DDR signaling is restored when cells are re-incubated in normal cell culture medium, which explains the moderate effects of hypertonic treatment on radiosensitization to killing observed. Collectively, global changes in chromatin massively perturb responses to DNA damage and risk genomic integrity. The action of hypotonic and hypertonic medium in altering chromatin structure is rather unspecific. Thus, more specific treatments like inhibitors of proteins influencing chromatin structure or genetically modified cell lines with loss-of-proteins that are known to facilitate, for example, chromatin condensation will help to further elucidate the role of chromatin structure in DDR signaling, DSB repair and DSB repair pathway choice.

Die Ergebnisse unserer Experimente zeigen, dass globale Veränderungen der Chromatinstruktur, die durch hypotone oder hypertone Behandlung hervorgerufen werden, schwerwiegende Auswirkungen auf die DDR Signalübertragung und die DSB Reparatur haben und somit die genomische Stabilität gefährden. Chromatinrelaxation allein verursacht ein vorübergehendes Stoppen der Zellen in der G2-Phase, möglicherweise resultierend aus einer ATM Aktivierung. Allerdings ist die DDR Signalübertragung, gemessen an der Bildung von pATM, γH2AX und 53BP1 Foci, nach Bestrahlung reduziert. Überraschenderweise können wir trotzdem eine starke G2-Kontrollpunktaktivierung nach DSB Induktion beobachten, die sowohl von ATR als auch von ATM abhängig ist. Weitere Untersuchungen der Signalübertragungen, die ATM vorausgehen, werden uns helfen diese unterschiedlichen ATM-vermittelten Endpunkte zu verstehen. Die in global relaxiertem Chromatin zu beobachtende, funktionsfähige DNA Resektion ermöglicht eine Kontrollpunktaktivierung durch ATR. Trotzdem ist die DSB Reparatur gestört, wie wir an einer weniger effizienten cNHEJ und vor allem an weniger HRR sehen. Auch altEJ kann die beiden Mechanismen nicht ersetzen; SSA ist dagegen dreifach verstärkt sobald die Zellen hypoton behandelt werden. Dieser Effekt wurde mithilfe von Reporter Zelllinien entdeckt und es wäre interessant auch die Reaktion des SSA auf strahlungsinduzierte DSBs in relaxiertem Chromatin zu untersuchen. Obwohl wir starke Beeinträchtigungen der Hauptreparaturwege beobachten und außerdem nur mutagene DSB Reparatur aktiv ist, sind die geringen Effekte der Chromatinrelaxation auf das Zellüberleben unerwartet. Da die kontinuierliche Behandlung der Zellen mit hypotonem Medium toxisch ist, erklärt die nach Anpassung des Protokolls nur noch vorübergehende Behandlung diese geringen Effekte auf das Überleben nach Bestrahlung. DDR Signalübertragungsexperimente und auch die Messungen des CCP zeigen, dass die Effekte der globalen Chromatinrelaxation, hervorgerufen durch hypotone Behandlung, komplett reversibel sind. Globale Chromatinkondensierung, erzeugt durch hypertone Behandlung, hält die Zellen in der G1-, G2- und M-Phase an, während die DDR Signalübertragung gemessen an der ATM Aktivierung und der H2AX Phosphorylierung nach Bestrahlung verstärkt wird. Jedoch ist die Aktivität aller untersuchten DSB Reparaturwege beeinträchtigt (cNHEJ) bzw. komplett unterbrochen (HRR, altEJ und SSA). Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass die DNA Resektion in kondensiertem Chromatin nicht mehr funktioniert, welche aber notwendig für die Reparatur durch HRR, altEJ und SSA ist. Daher könnte die funktionelle Aktivierung der Kontrollpunkte helfen die genomische Stabilität zu bewahren, obwohl die DSB Reparatur inhibiert ist. Chromatinkondensierung und die DDR Signalübertragung wird wiederhergestellt, sobald die Zellen in normalem Zellkulturmedium inkubiert werden. Das könnte ebenfalls eine Erklärung für die nur moderaten Effekte der hypertonen Behandlung auf das Überleben nach Bestrahlung sein. Zusammenfassend stören globale Änderungen der Chromatinstruktur massiv die Reaktionen der Zelle auf DNA-Schadensinduzierung und gefährden somit die genomische Integrität. Die chromatinverändernde Wirkung der hypotonen und hypertonen Medien ist eher unspezifischer Natur. Daher können spezifischere Behandlungen wie zum Beispiel das Nutzen von Inhibitoren bestimmter Chromatin beeinflussender Proteine oder genetisch modifzierte Zelllinien, denen Proteine fehlen, die an der Chromatinkondensierung beteiligt sind, helfen die Rolle der Chromatinstruktur hinsichtlich der DDR Signalübertragung, der DSB Reparatur und der Wahl des Reparaturweges weiter aufzuklären.

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Krieger, Lisa Marie: Global chromatin changes induced by altered tonicity interferes with DNA damage response signaling and DNA double-strand break repair. 2018.

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