Die Rolle der tumorrelevanten RhoA G17 Mutation in der Regulation von Aktin-assoziierten zellulären Prozessen
Die Proteine der Rho-GTPasen Familie gehören zu den Ras homologen Proteinen und sind seit langem für ihre kritische Rolle in dynamischen Zellprozessen, wie der Migration, der Polarisation und dem Zellzyklus, bekannt (Etienne-Manneville and Hall, 2002; Hall, 1998). Der Einfluss von Rho GTPasen auf zelluläre Prozesse erfolgt vorrangig durch die Generierung von dynamischen Aktinstrukturen (Hall, 1998; Nobes and Hall, 1995). Rho GTPasen fungieren als molekulare Schalter in der Signalweiterleitung, da sie in einem aktiven (GTP-gebunden) oder inaktiven (GDP-gebundenen) Zustand vorliegen können. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von Rho GTPase-abhängigen Signalvorgängen Auslöser krankhafter Veränderungen in Zellen, wie etwa bei der Entstehung von Krebs, sein kann (Etienne-Manneville and Hall, 2002; Karlsson et al., 2009). Nichtsdestotrotz, war lange unklar, welche Funktion Rho GTPasen in solchen pathologischen Prozessen einnehmen.
Kürzlich konnten Anhäufungen von Mutationen (R5, G17 und Y42) der Rho GTPase RhoA in Patientengruppen mit DGC (diffus gastric cancer) und anderen Krebsarten identifiziert werden (Bass et al., 2014; Kakiuchi et al., 2014). Jedoch sind betroffene Signalwege und ihre Relevanz in der Tumorigenese nicht vollständig aufgeklärt. Erste Studien zeigten, dass die Mutationen Y42C sowie G17V inaktiv vorliegen, was sich durch eine reduzierte Generierung von Aktin-Stressfasern zeigte (Chiba et al., 2015; Nagata et al., 2016). Trotz dieser ersten Hinweise sind der Wirkmechanismus von Tumor-assoziierten RhoA Mutanten und mögliche dominant negative Einflüsse weitestgehend unerforscht. Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Lücken in dem Verständnis der RhoA Mutanten, insbesondere der bisher nur wenig charakterisierten RhoA G17E Variante, zu schließen und neue Erkenntnisse hinsichtlich ihrer Relevanz in der Tumorigenese zu gewinnen. Hierzu wurden RNAi Experimente sowie Überexpressionsstudien durchgeführt und neben Western Blot Analysen der betroffenen Signalkaskaden die molekularen und zellulären Effekte mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass die RhoA G17E Mutante, ähnlich der G17V Variante, etablierte zelluläre Funktionen des RhoA Wildtyp nicht ausüben kann und somit inaktiv ist. Zum einen zeigte sich dies nach Überexpression von RhoA G17E in RhoA depletierten U-2 OS Zellen durch die deutlich verringerte Bildung von Aktin-Stressfasern. Des Weiteren führte die photochemische Rekrutierung der Mutante zur Plasmamembran nicht zur erwarteten Signalerhöhung eines etablierten Rho Aktivitätssensors.Die Brustkrebszelllinie BT-474 exprimiert RhoA G17E heterozygot (Wildtyp/G17E) und eignet sich somit gut zur Untersuchung der potentiellen zellulären Effekte dieser inaktiven RhoA Mutante. Interessanterweise hatte hier die Depletion des gesamten RhoA die verstärkte Generierung von kontraktilen Stressfasern zur Folge. Die Verstärkung deutet auf eine Überkompensation von RhoA abhängigen Prozessen möglicherweise durch verwandte Proteine und somit auf eine ursprünglich inhibitorische Wirkung der G17E Mutante hin. Im Einklang mit potentiell dominant negativen Effekten der Mutante auf endogenes RhoA Wildtyp führte die Überexpression von RhoA G17E in U-2 OS Zellen, welche nur den Wildtyp RhoA exprimieren, zur deutlichen Inhibition von Stressfasern. Des Weiteren wurde die Generierung von Stressfasern nach akuter Aktivierung des RhoA-spezifischen GEFs GEF-H1 durch die Überexpression von RhoA G17E signifikant inhibiert, was auf einen GEF-basierten dominant negativen Mechanismus hindeutet. So können dominant negative Effekte von inaktiven Rho Mutanten auf die Wildtyp Varianten über eine Blockierung von solchen Regulatoren verlaufen. In der Tat zeigte die akute Photoaktivierung der RhoA G17E Mutante eine im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Rekrutierung von GEF-H1 zur Plasmamembran, was für eine stärkere Interaktion mit diesem Rho spezifischen Aktivator spricht.
Neben den neuen Erkenntnissen hinsichtlich der mechanistischen Wirkungsweise von RhoA G17E auf das Wildtyp RhoA erbrachten die Studien in dieser Arbeit erste Hinweise auf potentielle Einflüsse der Mutante in Tumor-fördernden Prozessen. So führte die Depletion des gesamten RhoA (Wildtyp/G17E) in BT474 Zellen zu signifikant erhöhtem Zellsterben. Im Gegensatz hierzu war dies nach Depletion des Wildtyp alleine nicht der Fall, was für eine Abhängigkeit der BT-474 Zellen von der Expression des G17E spricht. Im Einklang mit dieser Schlussfolgerung zeigten Western Blot Analysen, dass die Mutante ebenfalls für die Aufrechterhaltung des Proteinkinase B (AKT) Signals in Zellen notwendig ist. Die Aktivität von AKT ist für eine Reihe von Signalkaskaden wichtig, welche das Zellüberleben kontrollieren. Stromabwärts von RhoA wird die Aktivität von AKT durch die Lipid-Phosphatase PTEN verringert. Die dominant negative Wirkung der G17E Mutation auf RhoA Wildtyp könnte somit über die Inhibierung von PTEN eine Stabilisierung von Zellüberlebenssignalen mit sich bringen und auf dieses Weise Tumor-fördernd wirken.The proteins of the Rho GTPase family form part of the Ras superfamily and are well-known for their critical roles in regulating dynamic cellular processes such as cell migration, cell polarization and cell cycle (Etienne-Manneville and Hall, 2002; Hall, 1998). In particular, Rho proteins control the formation of various dynamic actin structures (Hall, 1998; Nobes and Hall, 1995) by acting as molecular switches for regulatory processes via cycling between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. Thus, it is conceivable that aberrant Rho GTPase signaling could play major role in the progression of pathological processes such as in tumorigenesis (Etienne-Manneville and Hall, 2002; Karlsson et al., 2009). Despite much work has been performed that has provided significant knowledge on the cellular roles and mechanistic details of their functions, their role in pathological circumstances is still not well understood.
Recently, hot-spot mutations of RhoA (R5, G15 and Y42) were discovered in diffuse gastric cancer (DGC) patients and in other cancer types (Bass et al., 2014; Kakiuchi et al., 2014). However, affected pathways as well as their relevance in tumorigenesis are not well understood. Based on decreased formation of actin stress fibers, previous studies suggested that Y42C and G17V mutations are inactive (Chiba et al., 2015; Nagata et al., 2016). Despite these first findings, mechanisms underlying the inhibitory effects by these RhoA mutants and potential dominant negative mechanisms are unknown. The aim of this study was to fill this gap with a particular focus on the poorly characterized RhoA G17E variant in order to better understand its relevance for tumor cell behavior. To do so, a combinatorial approach including RNAi experiments, overexpression of mutants as well as biochemical analyses and fluorescence microscopy studies was used.
Overall, the mutant RhoA G17E, similar to G17V, was not able to substitute for RhoA wild type in mediating known cellular functions. In particular, overexpression of RhoA G17E in RhoA-depleted U-2 OS cells failed to rescue formation of actin stress fibers. Furthermore, while the light-induced recruitment of wild type RhoA caused significant increase of the fluorescent signal by a well-established Rho activity sensor, recruitment of RhoA G17E to the plasma membrane did not do so.
As BT-474 breast cancer cells are heterozygous for RhoA wild type and G17E, they can be used as a suitable system for characterizing potential dominant negative effects of the inactive RhoA mutant. Interestingly, selective depletion of the wild type RhoA in these cells did not alter neither the actin cytoskeleton nor the cell morphology. In contrast, simultaneous depletion of both RhoA wild type and G17E resulted in increased generation of actin stress fibers suggesting overcompensation by related Rho proteins that might be potentially inhibited by RhoA G17E.
To further establish such potential dominant negative effects of RhoA G17E on endogenous RhoA wild type, the mutant was overexpressed in U-2 OS cells, which are homozygous for RhoA wild type. This resulted in significantly decreased stress fiber formation, suggesting the inhibition of endogenous RhoA wild type function. Furthermore, the acute activation of this GEF in cells overexpressing RhoA G17E did not result in strong formation of stress fibers as compared to RhoA wild type, which is in accordance with a GEF-based dominant negative mechanism. It has been suggested that dominant negative effects of mutant GTPases on the corresponding wild type versions could be due to sequestering common upstream regulators. Indeed, light induced recruitment of RhoA G17E to the plasma membrane led to significant co-recruitment of GEF-H1 to this region as compared to wild type RhoA, thereby suggesting enhanced interaction of this mutant with GEF-H1.
Along with this new insight into the mechanism of RhoA G17E mediated inhibitory effects on RhoA wild type, evidence was revealed that this mutant potentially promotes tumor-related processes. In particular, overall depletion of RhoA (wild type/G17E) in BT-474 cells lead to increased cell death, while depletion of only wild type RhoA showed no such dramatic effect. This suggests that survival of BT-474 cells is dependent on the expression of RhoA G17E. In line with this, western blot analyses revealed that RhoA G17E is required for sustained levels of protein kinase B (AKT) activity in these cells. The activity of this kinase is important for a variety of signaling processes, which are involved in cell survival. Downstream of RhoA wild type, the lipid phosphatase PTEN inhibits the activity of AKT. Thus, the RhoA G17E mutant might promote tumor cell survival via suppressing activation of PTEN by RhoA in order to maintain sufficient levels of active AKT.