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Formation and Effects of Transformation Products during the Ozonation of Tamoxifen

Knoop, Oliver

Der Einsatz von Ozon hat sich als geeignet erwiesen, um eine Reduzierung der Mengen an Mikroschadstoffe und deren ökotoxikologischer Effekte zu erreichen, welche über gereinigtes Abwasser in die Umwelt eingetragen werden. Daher wird es in Kombination mit einer anschließenden biologischen Filtration als eine Möglichkeit der erweiterten Abwasserbehandlung in großem Umfang diskutiert. Besonders endokrine (hormonelle) Effekte können bereits durch geringe Konzentrationen von einer Vielzahl von Mikroschadstoffen induziert werden. Östrogene und androgene Effekte können durch den Einsatz von Ozon vermindert werden. Die Reaktionen von Ozon und Mikroschadstoffen, die diese Effekte verursachen, sind bereits gut untersucht. Im Gegensatz dazu wurde kürzlich berichtet, dass die antagonistischen Effekte durch diese Behandlung nicht entfernt werden können. Bisher sind nur wenige Informationen über Reaktionen von anti-östrogenen Verbindungen mit Ozon bekannt. Aus diesem Grund fokussiert sich diese Studie auf die Reaktion von Ozon mit Tamoxifen (TAM), einem selektivem Östrogenrezeptormodulator (SERM), der Bildung von Transformationsprodukten (TPs) und dem gleichzeitigen Verlauf der anti-östrogenen Aktivität und der akuten ökotoxikologischen Wirkung. Alle Versuche wurden in Reinstwasser in Anwesenheit eines Radikalfängers durchgeführt, um Radikalreaktionen auszuschließen und lediglich die Reaktion von TAM und Ozon, unter Berücksichtigung der Dissoziation in Abhängigkeit des pH, zu betrachten. Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mithilfe von Kompetitionskinetiken über einen weiten pH Bereich untersucht, um die speziesspezifischen kinetischen Konstanten zweiter Ordnung für die Reaktion von Ozon und TAM zu bestimmen. Die Geschwindigkeitskonstanten beider Spezies unterscheiden sich substanziell (k(TAM, O3) = 3.25 x 108 M-1 s-1; k(TAM-H+, O3) = 1.57 x 104 M-1 s-1). Daraus ergeben sich bei pH 7 kinetische Konstanten von > 106 M-1 s-1. Dementsprechend kann ein vollständiger Abbau von TAM durch den Einsatz von Ozon als erweiterte Abwasserbehandlung angenommen werden. Es ist zu betonen, dass für die neutrale Spezies, bei der das tertiäre Amin die reaktivste Gruppe für die Reaktion mit Ozon ist, eine unerwartet hohe kinetische Konstante zweiter Ordnung beobachtet wurde. Fünf TPs wurden mit Hilfe von hochauflösender Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie-basierter Strukturaufklärung, identifiziert. Die zwei primären TP, TP 270 (Criegee-Produkt) und TP 388 (Hydroxilierung), werden bei der Ozonierung der korrespondierenden Säure von TAM gebildet. Tamoxifen-N-oxid ist das primäre Produkt, das aus der Reaktion von Ozon mit der neutralen TAM-Spezies gebildet wird und wurde durch einen Referenzstandard identifiziert. Die weitergehende Oxidation der primären TPs durch Ozon führt zu der Bildung von TP 286 und TP 404 als sekundäre TP. Diese sind die korrespondierenden N-Oxide von TP 270 und TP 388. Die anti-östrogene Aktivität wurde mit dem hefebasiertem Arxula adeninivorans yeast estrogen screen (A-YES) assay bestimmt. Diese wurde ebenso wie die akute Toxizität für Daphnia magna und die Hemmung des Algenwachstums der Grünalge Desmodesmus subspicatus in Abhängigkeit von der Ozondosis bestimmt, um daraus den verbleibenden Effekt mit der Bildung von TPs zu korrelieren. Die anti-östrogene Aktivität blieb bei zunehmender Ozondosis, auch nach vollständiger Reduktion der TAM-Konzentration, erhalten. Der verbleibende Effekt konnte mit der Bildung von TP 270 korreliert werden. Die Bildung von N-Oxiden konnte hingegen mit einer Abnahme der anti-östrogene Aktivität korreliert werden. Die Immobilisierung von D. magna wurde bereits bei geringen Ozondosen komplett aufgehoben. Dahingegen wurde eine Zunahme der Wachstumshemmung von D. subspicatus mit steigender Ozondosis beobachtet. Auch hier korrelierte die Effektzunahme mit der Bildung von TP 270, aber auch TP 388. Bei pH 3 resultiert die Ozonierung von TAM in einer Verdopplung der anti-östrogenen Aktivität sowie auch der Hemmung des Algenwachstums. Hier war das Hauptprodukt TP 270, welches als 4-(Dimethylaminoethoxy)-benzophenone identifiziert wurde. Auf Grund des erhöhten Risikopotentials von TP 270 wurde eine neue Aufreinigungsstrategie erfolgreich entwickelt, um TP 270 hoher Reinheit für weitere Toxizitätstests zu gewinnen. In dieser Studie wurde die Reaktion von Ozon mit dem SERM TAM sowie die Bildung von primären und sekundären TPs untersucht. Zudem konnte die Bildung toxikologisch relevanter TPs nachgewiesen werden. Dadurch kann zu einem verbesserten Verständnis über die Beständigkeit anti-östrogener Effekte beim Einsatz von Ozon in der erweiterten Abwasseraufbereitung beitragen. Weitere Studien zur Ozonierung von SERMs, inklusive deren Metabolite, der Bildung von TPs in Abwasser und deren Entfernung durch nachgeschaltete biologische Filtration werden benötigt, um dieses Verständnis weiter auszubauen.

To reduce the amount of micropollutants and their ecotoxicological effects released into the environment via wastewater treatment plant (WWTP) effluents, ozonation showed to be suitable and is broadly discussed as advanced wastewater treatment (AWT) in combination with subsequent biological filtration. Especially endocrine effects can be induced at low concentrations of a broad range of micropollutants. Estrogenic and androgenic effects are diminished due to ozonation and the reactions of compounds inducing these effects are well investigated. In contrast, the corresponding antagonistic effects have recently been reported to be resilient to this treatment strategy and until now, only little information for the reaction of anti-estrogenic compounds with ozone is available. For this reason, this study focuses on the reaction of tamoxifen (TAM), a selective estrogen receptor modulators (SERM), with ozone, the formation of transformation products (TPs), and the simultaneous progression of anti-estrogenic activity and acute ecotoxicological effects. All experiments were performed in ultra-pure water in presence of radical scavengers to rule out radical reactions and focus solely on the reaction of TAM and ozone, including the dissociation of TAM in dependency of the pH. Reaction kinetics were investigated using a competition kinetics approach over a broad range of pH to determine the second order rate constants for the reactions of ozone with the corresponding species of TAM. Rate constants differed substantially between the two relevant TAM species (k(TAM, O3) = 3.25 x 108 M-1 s-1; k(TAM-H+, O3) = 1.57 x 104 M-1 s-1), resulting in an apparent second order rate constant of > 106 M-1 s-1 at pH 7. Hence, full abatement by ozonation as AWT can be assumed. However, for the neutral species with a tertiary amine as most reactive moiety towards ozone, the species specific second order rate constant obtained is unexpectedly high. Five TPs were identified in total using high resolution mass spectrometry and structure elucidation based on fragmentation in tandem mass spectrometry. Two primary TPs, TP 270 (Criegee product) and TP 388 (hydroxylation), are formed during the ozonation of the corresponding acid of TAM. TAM-N-oxide is the primary product formed in the reaction of the neutral TAM species and ozone and was unequivocally identified using a reference standard. Further oxidation of the primary TPs by ozone results in the formation of the two secondary TPs TP 286 and TP 404, the corresponding N-oxides of TP 270 and TP 388. Anti-estrogenic activity using the Arxula adeninivorans yeast estrogen screen (A-YES) assay, and acute toxicity for Daphnia magna and growth inhibition of the green algae Desmodesmus subspicatus were monitored in dependence of the ozone dose, to allow correlation analysis with the formation of TPs. The anti-estrogenic activity was proliferated with increasing ozone dose, even after full abatement of TAM, and the residual effect correlated to the formation of TP 270. The formation of N-oxides was on the other hand coherent with a loss of the anti-estrogenic activity. The observed immobilization of D. magna was removed at low ozone doses completely. An increase of the algae growth inhibition with an increasing ozone dose was observed, which correlated again with the formation of TP 270, as well as TP 388. At pH 3, ozonation of TAM resulted in a duplication of both effects, anti-estrogenic activity and algae growth inhibition. The main observed TP here was TP 270, which was identified as 4-(Dimethylaminoethoxy)-benzophenone. Due to the high risk potential of TP 270, a new purification strategy was successfully developed for obtaining pure TP270 for further toxicity testing by synthesis. This study elucidated the reaction of the SERM TAM with ozone and the formation of primary and secondary TPs. Additionally, the formation of toxicologically relevant TPs was demonstrated. Therefore, this study might help to understand the persistence of anti-estrogenic effects in ozonation as AVT. To further foster our understanding in that regard, future studies need to further investigate the ozonation of SERMs, including metabolites, formation of TPs in wastewater, and their removal in subsequent biological filtration.

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Knoop, Oliver: Formation and Effects of Transformation Products during the Ozonation of Tamoxifen. 2018.

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