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Relevance of the oncogene DJ-1, the tight junction protein Claudin-1 and the thyroid hormone transporter MCT8 for follicular thyroid carcinogenesis

Badziong, Julia

Kapitel 1: Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse und Schilddrüsenhormone spielen eine sehr wichtige Rolle im Stoffwechsel und beim Wachstum. Schilddrüsenhormone sind für viele Prozesse im menschlichen Körper wichtig und werden von nahezu allen Geweben und Organen benötigt. Die wichtigsten Schilddrüsenhormone sind das Trijodthyronin (T3) und das Thyroxin (T4). Fehlfunktionen der Schilddrüse kommen sehr häufig vor und können durch eine Überfunktion (Hyperthyreose) oder Unterfunktion (Hypothyreose) charakterisiert sein. Bösartige Schilddrüsentumore können in Tumore mit einer C-Zell-Differenzierung (MTC) oder in Tumore mit einer Follikel-Zell-Differenzierung (FTC, PTC, PDTC und ATC) unterteilt werden. Somatische Mutationen in SD-Karzinomen finden sich vorallem im PI3K- oder MAPK Signalweg. Allerdings ist immer noch unklar, welche Mechanismen die Tumorbiologie beeinflussen. Außerdem sind wir immer noch nicht in der Lage ein gutartiges follikuläres Adenom von einem bösartigen follikulären Karzinom zytologisch zu unterscheiden. Wir haben hier das putative Onkogen DJ-1 und das Tight Junction Protein Claudin-1 untersucht, da beide eine Rolle in der Tumorbiologie bei anderen Malignomen spielen. Wir haben ihre Expression mit Hilfe der Immunhistochemie in verschiedenen Schilddrüsentumoren untersucht und in vitro Experimente durchgeführt, um mehr über ihre Funktion in der Tumorbiologie zu erfahren. Zudem haben wir uns mit verschiedenen Schilddrüsenhormontransportern befasst und deren Expression in Schilddrüsentumoren und hyperfunktionellem Gewebe (Morbus Basedow) untersucht. Kapitel 2: Das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC) ist das zweithäufigste SD-Malignom. Es ist jedoch unklar, ob sich ein FTC sequenziell oder direkt aus einem follikulärem Adenom (FA) entwickelt und sowohl RAS-Mutationen als auch PAX8/PPARγ Rearrangements wurde in gutartigen sowie bösartigen follikulären Schilddrüsentumoren beschrieben. Eine erhöhte Expression des Proteins DJ-1 in FTC konnten wir bereits in früheren Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit haben wir untersucht, ob DJ-1 onkogenes Potenzial besitzt und ob DJ-1 eine Rolle in der Enstehung eines FTC spielt. Die Gen- und Proteinexpressionsanalysen wurden mit Hilfe von qRT-PCR und Immunhistochemie von insgesamt 116 Schilddrüsenproben, darunter 27 normale Schilddrüsen (NT), 44 FA und 45 FTC Proben, untersucht. Die Folgen einer DJ-1 Überexpression wurden in menschlichen follikulären Schilddrüsenkarzinomzellen (FTC-133) mit und ohne DJ-1 Herrunterregulation und in Ratten Schilddrüsenzellen (PCCL3) und humanen Schilddrüsenkarzinomzellen (FTC-133) mit DJ-1 Überexpression oder kombinierte Expression von DJ-1 mit den Onkogenen RASV12 und PAX8/PPARγ untersucht. Die Aktivierung von Schilddrüsensignalwegen wurde mit Hilfe des Immunblots untersucht. Wir konnten eine deutlich erhöhte Gen- und Proteinexpression von DJ-1 in den FTC Proben, im Vergleich zu FA und NT, finden. Die Herruntergregulation von DJ-1 in FTC-133 Zellen führt zu einer Verminderung des Migrations- und Invasionspotenzials. Eine Überexpression von DJ-1 in PCCL3 Zellen dagegen, führte zu einer erhöhten Proliferations- und Migrationsrate. DJ-1-RASV12 co-exprimierenden PCCL3 Zellen zeigten eine höhere Tumorigenität im Vergleich zu DJ-1 überexprimierenden Zellen, während eine solche Wirkung für DJ-1-PAX8/PPARγ co-exprimierende Zellen nicht bestätigt werden konnte. Unsere Daten deuten demnach darauf hin, dass DJ-1 als zusätzlicher Faktor in der Karzinogenese eines FTC wirkt und außerdem zur Tumoraggressivität beiträgt. Kapitel 3: Claudin-1 gehört zur Familie der transmembranen Tight Junction Proteine, welche die parazelluläre Spalte von Epithelzellen abdichten. Bei bösartigen Erkrankungen ist Claudin-1 oft anders reguliert und in subzellulären Kompartimenten angeordnet, insbesondere im Zellkern wo es das zelluläre Verhalten beeinflussen kann. Wir haben Claudin-1 im Bezug auf die biologischen Eigenschaften eines follikulären Schilddrüsenkarzinom (FTC) untersucht. Immunhistochemische Färbungen von Claudin-1 zeigten den Verlust der Membranexpression und eine gesteigerte Kernexpression in FTC Metastasen. Die Funktion von Claudin-1 wurde in zwei verschiedenen follikulären Schilddrüsenkarzinom Zelllinien untersucht: FTC-133 Zellen welche von einer regionalen Lymphknoten Metastase stammen und FTC-238 Zellen welche aus einer Lungenmetastase isoliert wurden. In beiden Zelllinien wurde Claudin-1 im Zellkern gefunden, wobei eine signifikant erhöhte claudin-1 Expression in FTC-238 Zellen im Vergleich zu FTC-133 Zellen gezeigt werden konnte. Interessanterweise, konnten wir in vitro zeigen, dass Claudin-1 verstärkt im Bereich der Wunde nach dem sogenannten Scratch Assay exprimiert wurde. Außerdem wurde eine Zunahme des pathogenen Charakters von FTC-133 Zellen, transfiziert mit RASV12, in Bezug auf eine gesteigerte Claudin-1 Expression sowie ehöhte Zellmigration, Invasion und Proliferation beobachtet. Auch eine Überexpression von Claudin-1 im Kern von FTC-133 Zellen führte zu einer erhöhten Zellmigration und Invasion. Im Gegensatz dazu zeigte die Transfektion mit Claudin-1 siRNA in FTC-238 Zellen eine verringerten Zellmigration und Invasion und wurde von einer reduzierten phosphoPKC Expression begleitet. Darüberhinaus führte eine Aktivierung der PKC zu einer erhöhten Claudin-1 Expression, während eine Inhibition der PKC zu einer verringerten Expression von Claudin-1 in FTC-133 Zellen führte. Diese Daten deuten darauf hin, dass Claudin-1 einen Einfluss auf die follikuläre Schilddrüsenkarzinomaggressivität hat, welche potenziell von der PKC Aktivität beeinflusst werden könnte. Kapitel 4: Der In- und Efflux von Schilddrüsenhormonen in verschiedene Gewebe wird durch Schilddrüsenhormontransporter erleichtert. Diese werden auch in der Schilddrüse exprimiert und spielen eine Rolle bei der Freisetzung von Schilddrüsenhormonen. Der physiologisch am besten untersuchte und selektivste Transporter ist der Monocarboxylattransporter 8 (MCT8), während die L-Typ Aminosäure Transporter LAT2, LAT3 und LAT4 auch andere Stoffe, wie Aminosäuren, transportieren. Wir haben uns gefragt, ob sich die Expression von Schilddrüsenhormontransportern mit der Schilddrüsendifferenzierung und Veränderung der Schilddrüsenfunktion ändert. Die Proteinexpression und Lokalisation von Schilddrüsenhormontransportern wurde mit Hilfe von Immunhistochemie in Proben von normalem Schilddrüsengewebe (NT, n = 19), follikulärem Adenom (FA, n = 44), follikulärem Schilddrüsenkarzinom (FTC, n = 45), papillärem Schilddrüsenkarzinom (PTC, n = 40), anaplastischem Schilddrüsenkarzinom (ATC, n = 40) und Schilddrüsen mit Morbus Basedow (GD, n = 50) untersucht. Färbeintensitäten wurden durch die Berechnung des „H-Score“ bewertet. Des Weiteren wurde die Regulation sowie Expression und Lokalisation von MCT8 in einer follikulären Rattenschilddrüsenzelllinie (PCCL3) unter basalen und Stimulationsbedigungen untersucht (TSH). Der Transporter MCT8 wurde im Schilddrüsengewebe in der Plasmamembran gefunden, während die LAT Transporter im Zytoplasma lokalisiert waren. In bösartigen Schilddrüsentumoren wurde MCT8 geringer exprimiert im Vergleich zu normalem Schilddrüsengewebe. Im Gegensatz dazu war die Expression von MCT8 und LAT4 im Basedow Gewebe signifikant erhöht. Außerdem wurde eine stärkere Expression von MCT8 in PCCL3 Zellen nach TSH Stimulation nachgewiesen. Die verringerte Expression von MCT8 bei Schilddrüsenkrebs qualifiziert MCT8 als Marker für eine Schilddrüsendifferenzierung. Das variable Expressionsmuster von LAT Transportern in den verschiedenen Schilddrüsentumoren scheint eher mit dem Transport von Aminosäuren als mit dem Efflux von Schilddrüsenhormonen verknüpft zu sein. Die durchgehend stark erhöhte Expression von Schilddrüsenhormontransportern in den Basedow Proben kann funktionell mit der erhöhten Freisetzung von Schilddrüsenhormone während einer Hyperthyreose verknüpft werden. Diese Annahme konnte durch in-vitro Stimulationsexperimente untersützt werden. Außerdem zeigten diese Versuche eine Verknüpfung von MCT8 Expression und dem cAMP abhängigen Signalweg.

Chapter 1: The thyroid is an endocrine gland and thyroid hormones play a huge role in metabolism and growth. Thyroid hormones are essential for a lot of processes in the human body and required for normal function of nearly all tissues. The most important thyroid hormones are triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). Thyroid dysfunction is very common and can be characterized by an overactive (hyperthyroidism) or an underactive (hypothyroidism) thyroid. Thyroid carcinomas can be divided into those with a C-cell differentiation (MTC) and those with a follicle cell differentiation (FTC, PTC, PDTC and ATC). Somatic mutations implicated either in the PI3K- or MAPK pathway occur with a high frequency in thyroid carcinomas but it is still unclear which mechanism influences tumour biology. Moreover, we are unable to distinguish between a benign follicular adenoma and a malignant thyroid carcinoma using cytology. Here we investigated the putative oncogene DJ-1 and the tight junction protein claudin-1 for their role in tumour biology. We analyzed their expression immunohistochemically in different thyroid tumours and performed in vitro experiments to learn more about their function in FTC tumour biology. Moreover, we addressed thyroid hormone transporter expression in thyroid tumours as well in hyperfunctioning tissues. Chapter 2: Follicular thyroid carcinoma (FTC) is the second most common thyroid malignancy. It is yet unclear, whether FTC evolves sequentially or distinctly from follicular adenoma (FA) and both RAS mutations and PAX8/PPARγ rearrangements have been reported in benign and malignant follicular thyroid tumours. Previously, we reported an increased expression of the protein DJ-1 in FTC. Here, we investigated whether DJ-1 has oncogenic potential due to the PI3K pathway and might thus play a role in FTC tumourigenesis. Gene and protein expression of DJ-1 were determined by qRT-PCR and immunohistochemistry in 116 thyroid specimen including 27 normal thyroid (NT) tissue, 44 FA and 45 FTC. Functional consequences of DJ-1 overexpression were investigated in human follicular thyroid carcinoma cells (FTC-133) with and without DJ-1 knockdown and rat follicular thyroid cells (PCCL3) as well as FTC-133 cells with DJ-1 overexpression or combined expression of DJ-1 with thyroid oncogenes RASV12 and PAX8/PPARγ. Activation of thyroid signaling pathways was investigated by immunoblot. In human FTC tissues, DJ-1 mRNA and protein levels were increased compared to NT and FA. Knockdown of DJ-1 in FTC-133 cells let to reduced migration and invasion capacity. DJ-1 overexpression in PCCL3 cells resulted in higher proliferation and increased migration rate. DJ-1-RASV12 co-expressing PCCL3 cells showed higher tumourigenicity as compared to DJ-1 PCCL3 cells, while no such effect was seen for DJ-1-PAX8/PPARγ PCCL3 cells. Higher protein expression of pAkt was found in DJ-1 overexpressing PCCL3 cells while expression levels of pAkt and pP70S6K were diminished. DJ-1 overexpression in FTC-133 cells resulted in a higher proliferation rate as compared to the EV and other overexpressing cells. Also migration of DJ-1 overexpressing cells was enhanced as compared to the EV transfected cells. Our data suggest that DJ-1 is an additive factor in follicular carcinogenesis contributing to tumour aggressiveness. Chapter 3: Claudin-1 belongs to the family of transmembrane tight junction proteins tightening the paracellular cleft of epithelial cells. In human malignancies, claudin-1 is often dysregulated and located in subcellular compartments, particularly in the nucleus where it may influence cellular behaviour. Here, we studied claudin-1 in relation to the biological characteristics of follicular thyroid carcinoma (FTC). Claudin-1 immuno-staining showed loss of membrane expression and increased nuclear claudin-1 localization in FTC metastases. claudin-1 function was further investigated in two different follicular thyroid carcinoma cell lines: FTC-133 isolated from a regional lymph node metastasis and FTC-238 derived from a lung metastasis. In both cell lines claudin-1 expression was demonstrated in the cell nuclei with a significantly higher protein expression in FTC-238 compared to FTC-133 cells. Interestingly, in vitro scratch assay revealed enriched nuclear claudin-1 expression near the scratch. Furthermore, the increase of the pathogenic character of FTC-133 cells by RASV12 transfection was associated with elevated claudin-1 expression and enhanced cell migration, invasion and proliferation. Likewise over-expression of nuclear claudin-1 in FTC-133 cells resulted in increased cell migration and invasion. Conversely, claudin-1 downregulation in FTC-238 cells by siRNA resulted in decreased cell migration and invasion and was accompanied by reduced phosphoPKC expression. Moreover, activation and inhibition of PKC resulted in claudin-1 up- and downregulation in FTC cells respectively. These data suggest an impact of claudin-1 on follicular thyroid carcinoma aggressiveness, which could potentially be influenced by PKC activity. Chapter 4: Influx and efflux of thyroid hormones (TH) into tissues is facilitated by TH transporters, which are also expressed in the thyroid and may play a role in thyroid hormone release. The physiologically most studied and TH-selective TH transporter is the monocarboxylate transporter 8 (MCT8), whereas the L-type amino acid transporters LAT2 and LAT4 also transport other substances. We asked whether expression of TH transporters is changed with thyroid dedifferentiation and alteration of thyroid function. Protein expression and localization of TH transporters was determined by immunohistochemistry in normal thyroid tissues (NT, n=19), follicular adenoma (FA, n=44), follicular thyroid carcinoma (FTC, n=45), papillary thyroid carcinoma (PTC, n=40), anaplastic thyroid carcinoma (ATC, n=40) and Graves’ disease tissues (GD, n=50). Staining intensities were evaluated by calculating the ‘hybrid’ (H) score. Furthermore, regulation of Mct8 expression and localization was investigated in the rat follicular thyroid cell line PCCL3 under basal and stimulation conditions (TSH). In thyroid tissues MCT8 was localized in the plasma membrane, while LAT transporters showed cytoplasmatic localization. MCT8 expression was downregulated in benign and malignant thyroid cancers as compared to normal thyroid tissue. In contrast, significant upregulation of MCT8, LAT2 and LAT4 was found in hyperfunctioning Graves’ tissues. Furthermore, a stronger expression of Mct8 was demonstrated in PCCL3 cells after TSH stimulation. Downregulation of MCT8 in thyroid cancers qualifies MCT8 as a marker of thyroid differentiation. The more variable expression of LATs in distinct thyroid malignancies may be linked with other transporter properties e.g. amino acid transport rather than TH efflux. The consistent strong upregulation of the TH transporters in Graves’ disease may functionally be linked to the increased TH-release in hyperthyroidism, an assumption supported by the in vitro results indicating upregulation of Mct8 through a cAMP dependent signalling pathway.

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Badziong, Julia: Relevance of the oncogene DJ-1, the tight junction protein Claudin-1 and the thyroid hormone transporter MCT8 for follicular thyroid carcinogenesis. 2018.

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