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Einfluss der viralen Sequenzvariabilität auf die Reaktivität von Hepatitis B Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen

Brinkmann, Janine

Weltweit leben etwa 257 Millionen Menschen mit einer Hepatitis B Virus Infektion. Jährlich führt dies zu rund 887.000 Todesfällen, trotz wirksamer Impfstrategien im Kindesalter, die weltweit implementiert sind. Etwa 5-10% aller Infektion im Erwachsenenalter entwickeln sich zu einer chronischen Infektion. Zudem verbleibt selbst in Patienten, die eine HBV-Infektion ausheilen, auch Jahre nach der Infektion die sogenannte cccDNA in den Hepatozyten. Die aktuell verfügbaren Therapiemöglichkeiten gehen entweder mit starken Nebenwirkungen einher, müssen ein Leben lang eingenommen werden oder führen zu Resistenzen des Virus. Mit neuen Therapieansätzen könnten diese Probleme gelöst werden. CD8+ T-Zellen sind an der Immunkontrolle einer HBV-Infektion beteiligt. Sowohl über direkt zytotoxische Mechanismen, als auch durch immunmodulatorische Funktionen. Insbesondere HBVcore-spezifische CD8+ T-Zellen konnten mit der Ausheilung von HBV-Infektionen korreliert werden. Sie sind somit attraktive Kandidaten für innovative Immuntherapien, wie therapeutische Impfstoffe oder adoptiven T Zelltransfer. Für diverse Viren sind Mechanismen der Immunevasion beschrieben, die die T-Zellreaktivität reduzieren und so die Effektivität T-Zellbasierter Immuntherapien in Frage stellen. Auch in dem immundominanten, HLA-A*02-restringierten Epitop HBVcore18-27 konnte eine Vielzahl an Polymorphismen identifiziert werden, die auf eine Immunevasion des HB-Virus hindeuten. Primär wurde daher in dieser Arbeit untersucht, ob sich die Hinweise auf Immunevasion auch funktionell anhand der Reaktivität der CD8+ T-Zellen bestätigen lassen. Zunächst wurde die Kreuzreaktivität von peripheren prototypspezifischen CD8+ T-Zellen von HLA-A*02-positiven Patienten mit chronischer HBV-Infektion untersucht. Da es zudem Hinweise auf die Bindung dieses Epitops durch Moleküle der HLA-Familien B*35 und B*51 gibt, wurde die CD8+ T-Zellfunktionalität auch in Patienten mit diesen HLA-Typen evaluiert. Ferner sollte beantwortet werden, ob die Substitutionen in diesem HBV-Epitop auf die Ebene der CD8+ T-Zellerkennung oder der Prozessierung einwirken. Dies wurde spezifisch für die herausstechende Substitution F24Y betrachtet. Des Weiteren wirken sich der Differenzierungsgrad sowie der Aktivierungsgrad von CD8+ T-Zellen auf ihre Funktionalität aus. Aufgrund dessen wurden HBVcore18-27-spezifische CD8+ T-Zellen von HLA-A*02:01-positiven Patienten zusätzlich phänotypisch charakterisiert. Die Sequenzanalyse der erweiterten Kohorte offenbarte eine deutlich diversere Sequenzvariabilität als zuvor von Kefalakes et al. beschrieben wurde. Die CD8+ T-Zellen von neun von 31 A*02:01-positiven, sechs von 23 B*35:01/03-positiven, vier von neun B*51-positiven und sechs von 15 Patienten mit kombiniertem HLA-Typ waren reaktiv gegenüber dem HBVcore18-27 Epitop. Diese prototypspezifischen CD8+ T-Zellen konnten auf ihre Kreuzreaktivität gegenüber 19 Varianten des Epitops untersucht werden. Entgegen der Erwartungen wiesen die CD8+ T-Zellen der HLA-A*02-positiven Patienten mit prototypspezifischer Respons eine breite Kreuzreaktivität gegenüber dem getesteten Spektrum der substituierten Aminosäuren auf. Dies schien in HLA-A*02:01 positiven Patienten besonders ausgeprägt zu sein, während HLA-B*51 positive Patienten kaum kreuzreaktive CD8+ T-Zellen verzeichnen. Der T-Zellrezeptor der individuellen CD8+ T-Zelle sollte maßgeblich an den individuellen Profilen beteiligt sein, wie anhand von CD8+ T-Zellklonen mit individuellem bekanntem TCR gezeigt werden konnte. Obwohl die Patienten, die HBV-Infektion nicht ausheilen konnten, wiesen ihre HBVcore18-27 spezifischen CD8+ T-Zellen keinen ausschließlich erschöpften Phänotyp auf, auch wenn sie im Vergleich mit denjenigen CD8+ T-Zellen, die keine HBVcore18-27 Spezifität aufwiesen, in diese Richtung tendierten. Dies unterschied sich auch nicht in Abhängigkeit der autologen viralen Sequenz. Sie wiesen gleichzeitige eine starke Expression des Marker CD127, der mit einem schnellen Proliferationsvermögen assoziiert ist, sowie einiger inhibitorischer Rezeptoren insbesondere des Erschöpfungsmarkers PD-1, auf, eine Kombination, die wahrscheinlich charakteristisch für spezifische T Lymphozyten des peripheren Bluts ist. Im Hinblick auf die spezifisch untersuchte Substitution F24Y ließ sich die Diskrepanz in der Sequenzevidenz und der Funktionalität der HBVcore18-27 spezifischen CD8+ T-Zellen durch eine Veränderung in der Prozessierung des Epitops in Anwesenheit der Substitution erklären. Dies wurde sowohl durch den proteasomalen Verdau der Vorläuferepitops, als auch durch die reduzierte Restimulationskapazität nach endogener Prozessierung deutlich. Dies könnte mit den identifizierten, niedrig aviden CMVpp65 (495-503) Epitopvarianten P498W und P498S als Kontrolle detaillierter auch für andere Substitutionen untersucht werden. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Arbeit daraufhin, dass sequenzbasierte Hinweise auf Immunevasion nicht vollständig mit der Funktionalität der CD8+ T-Zellen korrelieren müssen. Die mit exogen zugegebenem Peptid restimulierten HBVcore18-27 spezifischen CD8+ T-Zellen wiesen schließlich eine breite Kreuzreaktivität gegenüber einigen natürlich vorkommenden Epitopvarianten auf. Der Phänotyp und die autologe Virusvariante schienen dies nicht zu beeinflussen. Vielmehr zeigte sich eine Diskrepanz in der Kapazität T-Zellen zu restimulieren zwischen den exogen zugebenen Peptiden und der endogenen Prozessierung dieser. Die so gewonnenen Erkenntnisse untermauern die Notwendigkeit neuer Modelsysteme, wie beispielsweise NTCP-HepG2-Zellen. Mit diesen würden sich die Effekte von Polymorphismen auf die T Zellreaktivität vollständiger darstellen. Aspekte, die in der Infektionssituation ebenfalls von Bedeutung sind, wie die CD8+ T-Zellzytotoxizität oder Mechanismen zur Eliminierung der cccDNA könnten so gleichzeitig untersucht werden. Für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze bedarf es folglich noch ausgiebiger, weiterer Untersuchungen, die alle Aspekte einer HBV Infektion berücksichtigen. Hierbei sollte das Zusammenspiel der verschiedenen zellulären und humoralen Elemente des Immunsystems T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen oder neutralisierende Antikörper erwirkt werden, um langfristige Heilung und Immunität zu erreichen.

Worldwide 257 million people are estimated to be infected with the Hepatitis B virus. Despite global implementation of vaccinations in early childhood as effective preventive strategy, still, about 887,000 cases of death due to infection with HBV occur each year. Children up to the age of five are most susceptible for development of chronic hepatitis upon infection (90-95%), whereas, HBV infection in adults progresses to a chronic infection in only 5-10% of all cases. However, even in patients who resolve an acute HBV infection, the cccDNA remains in hepatocytes. All available therapy options for chronically infected patients either do have severe side-effects, need to be taken life-long or induce viral resistance. Moreover, none of the available therapies addresses the resolution of cccDNA. Novel therapeutic approaches might overcome these hurdles. CD8+ T cells are known to be involved in immune control of HBV infections. Both, cytotoxic and immunomodulatory mechanisms contribute to it. Particulary, CD8+ T cells specific for HBVcore are associated with recovery from an acute HBV infection. Therefore, these cells are interesting candidates for innovative immune therapies, such as therapeutic vaccination or adoptive T cell transfer. Several immune evasion mechanisms described for a broad range of viruses may affect T cell reactivity, questioning efficacy of prospective T cell-based immune therapies. Sequence based evidence for immune evasion has also been described for the immune dominant, HLA-A*02-restricted epitope HBVcore18-27 by Kefalakes et al.. Therefore, the primary aim of this thesis was to evaluate whether functional analyses of CD8+ T cell cross-reactivity supports the established sequence-based evidence for immune escape. A substantial expansion of the previously utilized patient cohort allowed detailed analysis of 291 epitope sequences in correlation with HLA-types. Taking these results into account, cross-reactivity of peripheral prototype specific CD8+ T cells of HLA A*02:01 positive patients chronically infected with HBV was determined. Due to reports stating that this epitope might also bind to HLA B*35- and HLA B*51-family members, functionality of CD8+ T cells was also evaluated in patients carrying these HLA alleles. Additionally, it was addressed whether these polymorphisms impact recognition by CD8+ T cells or epitope processing. The analysis focused on the particularly interesting substitution F24Y. Moreover, as functionality of CD8+ T cells is influenced by their degree of differentiation, exhaustion and activation, HBVcore18-27 specific CD8+ T cells were phenotypically characterized. Detailed analysis revealed a more diverse sequence variability than previously described, especially in HLA A*02:01 positive patients. CD8+ T cells of nine of 31 A*02:01 positive patients, six of 23 B*35:01/03 positive patients, four of nine B*51 positive patients and six of 15 patients expressing combinations showed reactivity against the prototypic HBVcore18-27 epitope, thus, cross-reactivity of these CD8+ T cells was determined. Contrary to what has been expected, cross-reactive responses of those prototype-specific CD8+ T cells were broadly detectable. CD8+ T cells of HLA A*02:01 positive patients were particularly broad, whereas HLA-B*51 positive patients’ T cells hardly exhibited any cross-reactivity. A major determinant of cross reactivity is the individual T cell receptor, as seen in profiles of CD8+ T cell clones with known T cell receptor. Despite their incapability to resolve an HBV infection, the HBVcore18-27 specific CD8+ T cells of these chronically infected patients did not express a completely exhausted phenotype independent of their autologous viral sequence. Both CD127, which is associated with fast proliferation capacity, and the inhibitory receptor, PD 1, particularly known as exhaustion marker, were strongly expressed – a characteristic combination of peripheral T lymphocytes. Differential processing of HBVcore18-27 and its F24Y variant delivered an explanation for the discrepancy in sequence based evidence and functional cross reactivity. A reduced restimulation capacity by the endogenously processed epitope as well as the differences in in vitro proteasomal digestion substantiates this. After comparative evaluation, CMVpp65(495-503) P498W and P498S, the identified CMV epitope variants with low avidity, may serve as control to broaden the range of HBV epitope variants assessed for their influence on endogenous processing. Taken together, sequence based evidence for immune evasion does not necessarily correlate with CD8+ T cell functionality. HBVcore18-27 specific CD8+ T cells appeared to be broadly cross-reactive to naturally occurring variants upon exogenous peptide restimulation. Phenotype and autologous viral sequence did not seem to affect recognition. In fact, assaying endogenous processing revealed a discrepancy in impact of exogenously added and endogenous processed epitopes on CD8+ T cell reactivity. This underpins the necessity for novel model systems, such as HBV permissive NTCP-HepG2 cells, for more detailed studies on the impact of polymorphisms on T cell reactivity. By this, other aspects of an infectious situation such as CD8+ T cell cytotoxicity or mechanisms to eliminate cccDNA may also be enabled to study. Novel therapeutic strategies, however, ask for further extensive research targeting all different aspects of an HBV infection. For cure and subsequent long-term immunity, both, cellular and humoral elements of the immune system should be addressed, keeping in mind their interplay. Thus, not only T cells, but also B cells, NK cells and neutralizing antibodies may be necessary to address in future research.

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Brinkmann, Janine: Einfluss der viralen Sequenzvariabilität auf die Reaktivität von Hepatitis B Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen. 2018.

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