Dissection and modulation of (patho)biological survivin functions by supramolecular ligands

Targeted cancer therapy provides a promising approach to fight cancer, the second leading cause of death worldwide following cardiovascular diseases, and reduces or avoids harmful side effects occurring in conventional chemo- and radiotherapy. This therapy addresses specific targets, which are preferentially or exclusively expressed in cancer cells. Survivin, highly up-regulated in almost all cancer types, represents such a target. Its overexpression is associated with resistance against chemo- and radiotherapy, frequent recurrences and decreased patient survival. As a member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family, Survivin plays a cytoprotective role by inhibiting cell death, but as part of the chromosomal passenger complex (CPC) it is also crucial for the regulation of mitosis. For both biological functions, an interaction with the nuclear export receptor CRM1, mediated by Survivin’s highly conserved, leucine-rich nuclear export signal (NES), is pivotal. However, the mechanisms regulating Survivin’s biological functions are still not completely resolved and a matter of scientific controversy. Thus, interference with the Survivin–CRM1 interaction could not only help to elucidate the distinct biological functions of Survivin but also to potentially inhibit cancer cell proliferation. Small molecule inhibitors of the export receptor CRM1 have already been identified. However, they supposedly also interfere with binding of CRM1 to other NES-bearing proteins, making them at most selective but clearly not specific.
Therefore, this work aims to signal-specifically target the NES of Survivin instead of the receptor and thereby to inhibit the interaction between the surface-exposed NES and CRM1 by supramolecular tweezer molecules, which are able to bind to surface-accessible lysine and arginine residues.
Establishing a robust protein expression and purification system enabled recombinant production not only of Survivin, but also of the high molecular weight export receptor CRM1 and its cofactor Ran for biochemical in vitro assays and structural analyses. Characterization of the purified proteins by circular dichroism (CD) spectroscopy revealed correct protein folding, while analytical gel filtration confirmed their theoretical molecular weight and demonstrated Survivin’s dimerization state. To improve binding affinity and specificity towards Survivin, a short peptide (ELTL) and an elongated version (ELTLGEFL), both mimicking the C-terminus of the NES and the overlapping dimer interface of Survivin, were linked to the basic tweezer as a second binding motif. Binding of the unmodified and both peptide-linked tweezer molecules to Survivin was demonstrated by ITC analyses with affinities in the micromolar range (20–30 μM). As expected, the tweezer bearing theelongated peptide ELTLGEFL had the highest affinity to Survivin. Moreover, NMR titration experiments confirmed tweezer binding to specific basic amino acids (K90/91, K103 and R106) within or near Survivin’s NES. Considering additional MD and QM/MM results, the tweezer modified with the short peptide ELTL revealed indeed a higher specificity to Survivin. Biochemical pull-down assays demonstrated that tweezers were indeed able to interfere with the Survivin–CRM1 interaction in vitro. This could not only be shown using purified proteins but also in competition with a variety of other potential cargo proteins in eukaryotic cell lysates. The effective inhibiting concentrations were 10–50 μM, agreeing with the results from ITC measurements. Peptide modifications of the tweezer molecules enhanced their ability to interfere with Survivin–CRM1 complex formation. Unexpectedly, mutations of the basic amino acids K90/91 and K103, supposedly involved in tweezer binding, to serine residues revealed an enhanced binding affinity of the basic and ELTL-linked tweezer. As this Survivin mutant exhibited structural defects affecting ITC results, the search for other suitable mutations is required. Nevertheless, investigations of this Survivin mutant in cell lysates revealed that all three tweezer molecules could not interfere with the Survivin–CRM1 interaction, thus suggesting that tweezer molecules mediate their inhibitory effect by specifically targeting lysines in Survivin’s NES and dimer interface.
In the future, the establishment of cellular assays for Survivin–CRM1 co-localization as well as the analysis of nuclear export activity enables cellular investigations of biological functions. Moreover, the discovery of cellular tweezer uptake will allow analyses of the effects a functional interference by supramolecular tweezers entails. A further improvement of binding affinity as well as specificity could be achieved by multivalency for example with a supramolecular ligand which combines two tweezer units anchored at two opposed sites of the NES and linked via an extended peptide sequence flanking and mimicking most of the NES. Moreover, nanoparticles and precision macromolecules covalently decorated with a combination of different Survivin NES-specific ligands would create additional hetero- and multiavidity.
To conclude, peptide modifications of supramolecular tweezer molecules seemed to be a promising strategy to successfully improve their affinity and specificity to Survivin as well as their ability to interfere with the Survivin–CRM1 interaction

Die zielgerichtete Krebstherapie bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung von Krebs, der weltweit zweithäufigsten Todesursache nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und verringert oder vermeidet dabei gesundheitliche Nebenwirkungen, die bei der konventionellen Chemo- und Strahlentherapie auftreten. Derartige Therapien adressieren spezifische Zielmoleküle, die bevorzugt oder ausschließlich in Krebszellen vorkommen. Survivin, das in fast allen Krebsarten hochreguliert ist, stellt ein solches Ziel dar. Die Überexpression von Survivin ist mit einer Resistenz gegen Chemo- und Strahlentherapie, einer erhöhten Rezidiv- sowie einer verminderten Überlebensrate der Patienten assoziiert. Als Mitglied der IAP-Proteinfamilie hemmt Survivin den Zelltod und besitzt somit eine zytoprotektive Aktivität, ist aber als Teil des CPC auch entscheidend an der Regulation der Mitose beteiligt. Für beide biologische Funktionen ist eine Interaktion mit dem nukleären Exportrezeptor CRM1 ausschlaggebend, die durch Survivins hochkonserviertes, Leucin-reiches NES vermittelt wird. Allerdings sind die Mechanismen, welche die biologischen Funktionen von Survivin regulieren, noch immer nicht vollständig geklärt und werden teilweise kontrovers diskutiert. Eine Inhibition der Survivin–CRM1-Interaktion könnte also nicht nur dazu beitragen, die biologischen Funktionen von Survivin aufzuklären, sondern zudem einen neuen Ansatz zur Hemmung der Krebszellproliferation darstellen. Inhibitoren des Exportrezeptors CRM1 wurden bereits identifiziert. Diese interferieren allerdings auch mit der Bindung von CRM1 an andere NES-tragende Proteine, was sie bestenfalls selektiv, aber nicht spezifisch wirksam macht.
Daher zielt diese Arbeit darauf ab, anstelle des Export-Rezeptors das NES von Survivin gezielt mit supramolekularen Pinzetten, die an oberflächenzugängliche Lysin- und Argininreste binden können, zu adressieren und dabei die aktivitätsvermittelnde Wechselwirkung zwischen Survivins oberflächenexponiertem NES und CRM1 zu stören.
Die Etablierung eines robusten Proteinexpressions- und Reinigungssystems ermöglichte die rekombinante Herstellung von Survivin, dem Exportrezeptor CRM1 sowie seinem Cofaktor Ran, die in biochemischen in vitro Experimenten und Strukturanalysen eingesetzt wurden. Durch die Charakterisierung aller gereinigten Proteine mittels CD-Spektroskopie konnte ihre korrekte Proteinfaltung nachgewiesen werden. Die analytische Gelfiltration bestätigte ihr theoretisches Molekulargewicht und die Dimerisierung von Survivin. Um die Bindungsaffinität und Spezifität gegenüber Survivin zu verbessern, wurden ein kurzes (ELTL) und ein verlängertes Peptid (ELTLGEFL), die sowohl den C-terminalen Teil des NES als auch die überlappende Dimerisierungsregion von Survivin nachahmen, als zweites Bindungsmotiv kovalent an das Pinzetten-Grundmolekül gebunden. Die Bindung der unmodifizierten und der beiden Peptid-gebundenen Pinzetten an Survivin konnte durch ITC-Analysen mit Affinitäten im mikromolaren Bereich (20–30 μM) gezeigt werden. Tatsächlich wies die Pinzette mit dem verlängerten Peptid ELTLGEFL dabei die höchste Affinität zu Survivin auf. Darüber hinaus wurde die Bindung an bestimmte basische Aminosäuren (K90/91, K103 und R106) innerhalb oder in der Nähe des NES durch NMR-Titrationsexperimente nachgewiesen. Unter Berücksichtigung zusätzlicher Ergebnisse aus MD- sowie QM/MM-Studien konnte für die ELTL-gebundene Pinzette eine höhere Spezifität zu Survivin gezeigt werden. Biochemische Pull-down-Experimente konnten belegen, dass die Pinzetten die Survivin–CRM1-Interaktion in vitro hemmen. Dies konnte nicht nur mit gereinigten Proteinen bestätigt werden, sondern auch in eukaryotischen Zelllysaten, in denen Survivin mit vielen anderen potenziellen Frachtproteinen von CRM1 konkurrierte. Die effektiven Inhibitorkonzentrationen lagen in Einklang mit den ITC-Ergebnissen zwischen 10 und 50 μM. Darüber hinaus zeigten die Peptid-gebundenen Pinzetten ein erhöhtes Hemmungspotential gegenüber der Survivin–CRM1-Komplexbildung. Unerwarteterweise zeigten Mutationen der vermutlich an der Pinzettenbindung beteiligten basischen Aminosäuren K90/91 und K103 zu Serin eine erhöhte Bindungsaffinität für die unmodifizierte sowie die ELTL-verknüpfte Pinzette. Da diese Survivin-Mutante aber erhebliche strukturelle, die ITC-Ergebnisse beeinflussende Defekte aufwies, ist hier der Einbau von besser geeigneten Mutationen erforderlich. Gleichwohl zeigten Untersuchungen mit dieser Survivin-Mutante in Zelllysaten, dass hier keine der drei Pinzetten die Survivin–CRM1-Wechselwirkung zu beeinflussen vermochte. Dies lässt vermuten, dass die Pinzetten ihre inhibitorische Wirkung tatsächlich über die gezielte Bindung von Lysinen in Survivins NES und Dimerisierungsregion vermitteln.
Zukünftig wird die Etablierung zellulärer Experimente zum Nachweis der Survivin–CRM1-Co-Lokalisation sowie zur Analyse der nukleären Exportaktivität weiterführende Untersuchungen der biologischen Funktion von Survivin ermöglichen. Der Nachweis der zellulären Aufnahme der supramolekularen Pinzetten wird weiterhin Analysen möglicher Interferenzeffekte erlauben. Eine weitere Verbesserung der Bindungsaffinität sowie der Spezifität könnte durch Multivalenz erreicht werden, beispielsweise mit einem supramolekularen Liganden, welcher beispielsweise zwei Pinzetteneinheiten kombiniert. Diese könnten an zwei Bindestellen im NES und der Dimerisierungsregion verankert und über eine ausgedehnte Peptidsequenz verbunden sein, die das NES größtenteils nachahmt und dadurch flankiert. Darüber hinaus würden Nanopartikel sowie Präzisionsmakromoleküle, die kovalent mit verschiedenen NES-spezifischen Liganden dekoriert sind, zusätzliche Hetero- und Multiavidität erzeugen.
Zusammenfassend stellt die Modifikation der supramolekularen Pinzetten mit Peptiden als zweites Bindemotiv eine vielversprechende Strategie dar, um deren Affinität sowie Spezifität und damit ihr inhibitorisches Potential gegenüber der Survivin–CRM1-Interaktion zu verbessern.

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