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Biofilm formation by the manganese-oxidizing bacterium Leptothrix discophora strain SS-1 and corrosion of stainless steel

Thyssen, Christian

Nowadays it is generally accepted that microorganisms play a pivotal role in corrosion, by influencing and/or accelerating the electrochemical corrosion processes. Microbiologically influenced corrosion (MIC) is associated with biofilm formation leading to (in)direct changes of the materials surface characteristics. The biofilm is consisting of a heterogeneous matrix of extracellular polymeric substances (EPS), which is comprised mainly (in addition to water) of polysaccharides, proteins, lipids, and nucleic acids. The metabolic activity of biofilm cells and the EPS itself strongly influence the interfacial processes associated with the electrochemical processes. In this study the importance of biofilm formation and manganese oxidation for the corrosion of stainless steel was elucidate by using Leptothrix discophora SS-1 as model organism. The growth of L. discophora SS-1 cells was tested with two different growth media with and without addition of manganese ions. It was shown that the addition of manganese ions resulted in an increased lag phase as well as an increase in generation time (from approximately 2 h to 3 h). Concomitant with the oxidation of manganese(II) ions to manganese(IV) oxides the total ATP and protein content of stationary cultures decreased up to 40 % and 55 %, respectively. This indicates a negative effect of manganese ions on the physiology of L. discophora SS-1. The analysis of the (EPS) under four different growth conditions showed that L. discophora SS-1 adapts its EPS to the environmental conditions and that the EPS possess all features to facilitate biofilm formation on SS. The amount of uronic acids was increased in EPS extracted from cells grown in the presence of manganese ions. This indicates that the carboxyl groups of uronic acids might be involved in retaining manganese ions in the EPS for subsequent oxidation. Analysis of (un)saturated fatty acids identified C18:1 as a unique unsaturated fatty acid only present in EPS of cells grown in the presence of manganese ions. Additionally, the fatty acids C8:0 and C16:0 were downregulated while C12:0 was upregulated in EPS of cells grown in presence of manganese ions. The main fatty acid under all conditions was C16:1, which is in agreement with literature reports for the Leptothrix group. Fluorescent lectin binding analysis (FLBA) and EPS analysis proved to be a useful combination to identify carbohydrate monomers (in case of FLBA by the ability of lectins to bind to certain glycoconjugate residues) and to identify genuine features of the biofilm. Sorbitol, mannose and rhamnose represent the major carbohydrate constituents in EPS of L. discophora SS-1. The lectins ConA, GS-II, PWM and LPA were specific for EPS of L. discophora SS-1 under all conditions. A particular striking staining feature was observed for the lectins MPA, PWM, DBA and UEA-I. These lectins stained repeatedly a filament-like structure connecting the separated individual cells. Analysis of contact potential difference (CPD) mapping (measurement of the surface potential) and corrosion measurements strongly indicates an effect of biofilm formation concomitant with manganese oxidation for the electrochemical degradation of stainless steel. Single cells and microcolonies were successfully labeled by fluorescence staining and in combination with Leucoberbelin blue allowed an identification of cells, microcolonies and manganese oxides on the surface. CPD mapping identified manganese oxides as cathodic areas with a negative CPD (-220 mV) and anodic areas (regularly but not always associated with identified cells) with a positive CPD (+200 mV) towards the steel surface. The potential difference of up to 420 mV between cathodic and anodic areas correlates with the 400 mV anodic shift (ennoblement) observed in open circuit potential (OCP) measurements with biofilms of L. discophora SS-1 cells precipitating manganese oxides on a stainless steel surface. The OCP shifted from initially 242 mVshe (uninfluenced by biofilms or manganese oxides) to 635 mVshe, which is well beyond the determined pitting potential (416 mVshe to 511 mVshe) of the stainless steel under the given conditions. Thus, the ennoblement of the stainless steel caused by bacteria and manganese oxides could directly be shown by this technique.

Es ist heutzutage allgemein anerkannt, dass Mikroorganismen eine zentrale Rolle in der Korrosion einnehmen, indem sie die elektrochemischen Korrosionsprozesse beeinflussen und/oder beschleunigen. Mikrobiologisch beeinflusste Korrosion (MIC) ist in der Regel mit der Bildung von Biofilmen verbunden, welche zu direkten oder indirekten Veränderungen der Materialeigenschaften an den Grenzflächen zwischen Biofilm und Materialoberfläche führen. Biofilme bestehen nebst Wasser aus einer heterogenen Matrix extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS). EPS besteht hauptsächlich aus Polysacchariden, Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren. Die Stoffwechselaktivität der Bakterien im Biofilm und die EPS selbst beeinflussen die elektrochemischen Prozesse in höchstem Maße. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung und der Einfluss der Biofilmbildung und der Manganoxidation auf die Korrosion von Edelstahl unter Verwendung von Leptothrix discophora SS-1 als Modellorganismus untersucht. Das Wachstum von L. discophora SS-1 wurde mit zwei verschiedenen Wachstumsmedien mit und ohne Zugabe von Manganionen getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von Manganionen zu einer verlängerten Lag-Phase sowie einer Verlängerung der Generationszeit führte (von ca. 2 h auf 3 h). Zusammen mit der Oxidation von Mangan(II)-Ionen zu Mangan(IV)-Oxiden sank der Gesamtgehalt an ATP und Protein in stationären Kulturen um bis zu 40 % bzw. 55 %. Dies deutet auf einen negativen Einfluss von Mangan-Ionen auf die Physiologie von L. discophora SS-1 hin. Die Analyse der EPS unter vier verschiedenen Wachstumsbedingungen zeigte, dass L. discophora SS-1 sein EPS an die Umweltbedingungen anpasst und dass die EPS alle Eigenschaften besitzt, um die Biofilmbildung auf Edelstahl zu ermöglichen. Die EPS von Zellen welche in Gegenwart von Manganionen angezogen wurden zeigte eine erhöhte Menge an Uronsäuren. Dies deutet darauf hin, dass die Carboxylgruppen der Uronsäuren Manganionen für die nachfolgende Oxidation in der EPS komplexieren können. Die Analyse von (un)gesättigten Fettsäuren zeigte u.a., dass C18:1 nur in EPS von Zellen vorhanden ist, die in Gegenwart von Manganionen angezogen wurden. Zusätzlich wurden die Fettsäuren C8:0 und C16:0 durch Zugabe von Manganionen in das Anzuchtmedium herunterreguliert, während C12:0 hochreguliert wurde. Den Hauptbestandteil der Fettsäuren machte unter allen Bedingungen C16:1 aus. Dies stimmt mit Literaturberichten für die Leptothrix-Gruppe überein. Die Analyse des Bindungsverhaltens von fluoreszierenden Lektinen (FLBA) in Kombination mit der EPS-Analyse erwiesen sich als geeignet, um Kohlenhydratmonomere (im Falle von FLBA durch die Fähigkeit von Lektinen, an bestimmte Glykokonjugate zu binden) in Biofilmen zu identifizieren. Sorbitol, Mannose und Rhamnose repräsentieren die Hauptbestandteile der Kohlenhydrate in EPS von L. discophora SS-1. Die Lektine ConA, GS II, PWM und LPA zeigten ein positives Bindungsverhalten für EPS von L. discophora SS 1 unter allen Bedingungen. Ein besonders auffallendes Merkmal förderten die Lekine MPA, PWM, DBA und UEA-I zu Tage. Diese Lektine färbten wiederholt eine filamentartige Struktur, die einzelne voneinander getrennte Zellen durch eine äußere Hülle verbindet. Die Analyse der Kontaktpotentialdifferenz (CPD) (Messung des Oberflächenpotentials) und die Korrosionsmessungen zeigten einen hohe Kausalität zwischen der Biofilmbildung in Kombination mit Manganoxidation und der Korrosion von Edelstahl. Einzelzellen und Mikrokolonien wurden erfolgreich durch Fluoreszenzfärbung markiert. Dies ermöglichte in Kombination mit Leucoberbelin-Blau eine Identifizierung von Zellen, Mikrokolonien und Manganoxiden auf der Oberfläche des Edelstahls. Die Analyse der CPD identifizierte Manganoxide als kathodische Bereiche mit einem negativen Potential (-220 mV) und anodische Bereiche (regelmäßig, aber nicht immer assoziiert mit identifizierten Zellen) mit einem positiven Potential (+200 mV) gegenüber der Stahloberfläche. Die Potentialdifferenz von bis zu 420 mV zwischen kathodischen und anodischen Bereichen korreliert mit der anodischen Verschiebung (Ennoblement) um 400 mV, ausgelöst durch Biofilme von L. discophora SS-1-Zellen welche aktiv Manganoxide auf der Edelstahloberfläche abschieden. Das OCP verlagerte sich von anfänglich 242 mVshe (unbeeinflusst von Biofilmen oder Manganoxiden) auf 635 mVshe. Dies liegt deutlich über dem ermittelten Lochfraßpotential (416 mVshe bis 511 mVshe) des Edelstahls unter den gegebenen Bedingungen. So konnte der Zusammenhang von Korrosion und der Biofilmbildung sowie Manganoxidation durch L. discophora SS-1 direkt gezeigt werden.

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Thyssen, Christian: Biofilm formation by the manganese-oxidizing bacterium Leptothrix discophora strain SS-1 and corrosion of stainless steel. 2018.

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