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Charakterisierung von Stamm- und Vorläuferzellen der Cornea

Döpper, Hannah

Trotz der bisherigen wissenschaftlichen und klinischen Fortschritte ist es bis heute nicht detailliert geklärt, welche Faktoren für die Rekonstruktion und Er-haltung der beschädigten Cornea verantwortlich sind. Daher ist es immer noch von großem Interesse die Identität und Funktionsweise der Stamm- und Vorläuferzellen des Limbus zu untersuchen, und so die Therapiemöglichkeiten für Patienten mit LSCD weiter verbessern zu können. Daher stellte das erste Ziel der vorliegenden Arbeit die Generierung eines neuen Doxyzyklin-induzierbaren, lentiviralen Vektors zur Aufreinigung von label-retaining-Zellen dar. Die bisher generierten Ergebnisse an humanen Limbuszellen zeigen, dass dieser Vektor dazu verwendet werden kann eine Population von Zellen mit einem langsameren Zellzyklus zu identifizieren. Zur anschleißenden Validierung des Stammzellpotentials der unterschiedlichen Subpopulationen müssen nachfolgend funktionelle Untersuchungen durch-geführt werden. Ist die Population mit dem größten Stammzellpotential identifi-ziert, könnten sich nachfolgende Experimente mit der genaueren Charakteri-sierung dieser Population befassen. Die Vorteile des label-retaining-Vektors liegen in der stabilen Transduktion, der strengen Regulierbarkeit durch Doxyzyklin, sowie der simplen Detektierbarkeit des GFP im Gegensatz zur aufwändigen Immunfluoreszenz-basierten Detektion bei BrdU. Dieser Vektor stellt ein neues Werkzeug zur Aufreinigung von lebensfähigen putativen Stamm- und Vorläuferzellen der Cornea innerhalb einer Population von LRZ dar. Eine Anwendung zur Untersuchung von Stammzellpopulationen in vielen anderen Geweben ist ebenfalls möglich. Ein weiterer Ansatz für die Behandlung von LSCD ist die Generierung von iPS-abgeleiteten Transplantaten. Die Reprogrammierung von Patienten-eigenen Hautfibroblasten zu iPSZ stellt für Patienten mit bilateraler LSCD ei-nen guten Therapieansatz dar. Aus einer minimalinvasiv gewonnenen Hautstanze werden zunächst reprogrammierbare Fibroblasten herangezogen. So-bald aus diesen iPSZ generiert wurden, könnten diese dann gezielt zu hCEZ differenziert werden um so ein patienten-spezifisches Transplantat zu erhalten. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit hESZ gezielt zu Zellen des Corneaepithels differenziert und dabei der Einfluss verschiedener Transkripti-onsfaktoren auf die Differenzierung untersucht, um so Erkenntnisse darüber zu gewinnen, welche regulatorische Mechanismen an der Entstehung von Cornea-Epithelzellen beteiligt sind. Diese Erkenntnisse könnten dazu genutzt werden, um die Generierung iPS-basierter Transplantate zur Behandlung der LSCD zu verbessern. Zunächst konnte jedoch festgestellt werden, dass die ektope Expression von wichtigen Transkriptionsfaktoren der Augenmorphogenese nicht dazu geeignet ist, die Effizienz dieser Differenzierung zu steigern. Vielmehr zeigte insbesondere die Expression unter dem methylierungsprotektiven Einfluss des UCOE-Elements, dass die ektopte Expression dieser Tran-skriptionsfaktoren keinen gezielten Effekt auf die Differenzierung hat. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren sind an vielen verschiedenen Prozessen der Augenmorphogenese beteiligt, sodass die Begünstigung des cornealen Zellschicksals nicht auf diesem Wege spezifisch begünstigt werden kann. Wird dieser Ansatz jedoch mit verfeinerten Methoden, wie z. B. induzierbaren Vektoren und Reportersystemen weiterverfolgt, so können neue Erkenntnisse zu diesem Thema gewonnen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Anreicherung der spontan während der direkten Differenzierung entstandenen Pigmentzellen. Diese konnten nachfolgend RPE-Zellen identifiziert und gezielt angereichert wer-den. Dabei stellte sich heraus, dass die mit SIX1 bzw. SIX1-UCOE transduzierten hESZ im Verlauf der Differenzierung signifikant mehr RPE-Zellen hervorbrachten. Die Anreicherung dieser Zellen verlief, unabhängig von dem exprimierten Transkriptionsfaktoren, erfolgreich. Dies kann als Hinweis darauf ein-geordnet werden, dass SIX1 eine Rolle während der Entscheidung über das Zellschicksal zugunsten der RPE-Zellen spielt, nicht jedoch darüber hinaus. Außerdem wiesen die RPE-Zellen, welche aus den SIX2-exprimierenden hESZ abgeleitet wurden, hohe relative Transkriptmengen des Gens RLBP1 auf. Da es sich hierbei um ein für den Sehzyklus unabdingares Gen handelt, sollte in folgenden Experimenten der Zusammenhang zwischen SIX2 und RLBP1 tiefergehend untersucht werden. Außerdem zeigte sich in einem Pilotversuch, dass von den hier generierten RPE-Zellen ausschließlich die ITGB4-positiven Zellen die typische Morphologie und Pigmentierung der RPE-Zellen aufwiesen und zudem eine höhere Expression von RPE-typischen Genen zeigten. Im Hinblick darauf, dass seit Jahren mit Hochdruck daran geforscht wird, gezielt aus patienteneigenen iPSZ transplantierbare RPE-Zellen für die Behandlung der AMD zu gewinnen, können die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit als Ansatzpunkt für nachfolgende Untersuchungen genutzt werden, welche zur Verbesserung dieses Therapieansatzes beitragen können.

In spite of all scientific progress and therapeutic approaches the factors responsible for corneal reconstruction and homeostasis still remain ill-defined. Hence, it is of great scientific interest to study the identity and functionality of limbal stem- and progenitor cells. New insights could be used to improve treatment options of patients suffering from LSCD. Consequently, the first aim of this thesis was the generation of a novel, inducible, lentiviral vector to enrich viable label retaining cells (LRCs). The testing of this vector on human limbal epithelial cells revealed, that it is possible to specifically identify a population of LRCs. Nevertheless, it is necessary to perform experiments to quantify the stem cell potential of the different sub-populations. Once the population with the highest stem cell potential is identified, the cells within this population could be further characterized to study characteristics of human limbal epithelial stem cells (hLESCs). This label-retaining-vector benefits from the stable transduction, simple detectability and stringent controllability. Thus, this novel inducible label-retaing vector is a powerful new tool for the identification of stem- and progenitor cells of the human cornea within a popoulation of LRCs. Additionally, it is also possible to use this vector to study stem cell populations in a variety of other tissues. A different treatment approach for LSCD is the generation of iPSC-derived transplants. Especially for patients with bilateral LSCD the reprogramming of patient-derived skin fibroblasts to iPSCs is a promising new treatment option, as minimally invasive skin punches replace limbal explants. As soon as the fibroblasts are reprogammed to iPSCs they could be differentiated into human corneal epithelial cells (hCECs) to generate a patient-tailored transplantable corneal cell sheet. Thus, the aim of the second part of this thesis was to differentiate human embryonic stem cells into hCECs. Additionally, the effect of different transcription factors (TFs) on the process of this differentiation was studied, to gain new insights into the regulatory mechanisms of corneal development. This knowledge could be useful for optimizing the generation of iPSC derived cornea transplants. The most striking finding was, that the ectopic expression of essential TFs for eye development, is not suitable to enhance the differentiation efficiency. In fact, especially the expression of these TFs under the protecting influence of the UCOE-element, revealed that this approach did not lead to a targeted influence on the differentiation. The TFs used in this study are involved in many different processes of eye morphogenesis. Hence, a specific promotion of a corneal cell fate is not possible with this method. The third part of this thesis dealt with the enrichment of spontanously arising pigmented cells throughout the directed ectodermal differentiation. These cells were identified as cells of the retinal pigmented epithelium and were subsequently specifically enriched. It was shown that SIX1 resp. SIX1-UCOE-expressing human embryonic stem cells (hESCs) generate significantly more RPE-cells than untransduced hESC or hESC transduced with other transcription factors. These RPE-cells were successfully enriched, independent of the ectopically expressed trancription factors. This indicates that SIX1 might play a role during cell fate decision in favour of RPE cells, but not beyond. However, this hypothesis has to be confirmed or denied by further studies. Another interesting finding was that RPE cells which were derived from SIX2-expressing hESCs expressed higher amounts of the gene RLBP1. Since RLBP1 is an important component of the visual cycle and therefore for the RPE-function, this finding should also be addressed further. Moreover, a pilot study revealed, that Integrin β4 may be a promising candidate for the enrichment of transplantable RPE cells. In this study, the ITGB4-positive cells showed the typical morphology and pigmentation of RPE cells and additionally expressed higher amounts of RPE-typical genes, compared to the ITGB4-negative cells. In the last years massive scientific effort has been made to specifically generate transplantable RPE cells from patient-tailored iPSCs as a treatment for AMD. Hence, the diverse data situation found in this thesis, reveals new attempts to possibly improve iPSC-derived RPE cells as a treatment option for AMD patients.

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Döpper, Hannah: Charakterisierung von Stamm- und Vorläuferzellen der Cornea. 2018.

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