Identification and characterization of novel Taspase1 target proteins

Cancer diseases constitute the second leading cause of death amongst the european population, surpassed only by cardiovascular diseases (Townsend et al.,2016). In Germany in 2012 2.4 % of all new cancer incidents were malignent diseases of the hematopoetic or lympatic system. 12,640 people in Germany were diagnosed with leukemia in 2012, with 5 % them being younger than 15 years (Institute, 2012). In the years 2008-2010 the overall five-year-survival rate for CML and CLL leukemia patients in Germany was approximately 70 % and 76 %, respectively, meaning that more than two thirds of patients are alive 5 years after they have been diagnosed with either of these types of leukemia. In contrast, AML and ALL leukemia patients have much more dire prognoses with only 24 % (AML) and 43
% (ALL) of individuals surviving past the 5 year mark (Nennecke et al., 2013). Approximately half of ALL leukemias and 10 % of AML leukemias are associated with MLL translocations (H. Liu, E. H. Y. Cheng, and J. J. D. Hsieh, 2009). AF4 is one of the most frequent translocation partners that forms in-frame fusion genes with MLL (Meyer, Schneider, et al., 2006; Kowarz et al., 2007). The AF4-MLL derivative resulting from reciprocal T(4;11) chromosomal translocation events is activated and stabilized via proteolysis by Taspase1 and contributes to the cancer phenotype (Bursen, Moritz, et al., 2004). Also, Taspase1 overexpression was documented in various solid cancer types (D. Y. Chen, H. Liu, et al., 2010; Knauer et al., 2011) indicating a more general role of this protease in cancer diseases. Taspase1 is therefore considered a potential novel target for future cancer therapies. However, the exact role of Taspase1 in cancer development and maintenance is still unclear, due to our limited knowledge of its activation mechanism, its degradome and how
its activity is embedded into the network supporting tumor growth. Taspase1 inhibition as a treatment for leukemia and other cancer types is only valid when the downstream effects do not compromise vital cellular function. It is therefore crucial to assess the effect of its inhibition by identifying Taspase1 substrates and determining
any altered functions that arise from their proteolytic cleavage. To close
some gaps in our knowledge about Taspase1 we attempted to verify and characterize a selection of bona fide targets that were identified by (Bier, Knauer, Docter, et al., 2011) (EVI5, REV3L, RbGP1, IPPK and USF2). We successfully cloned full length versions of the putative targets RbGP1, IPPK and REV3L. Due to very low expression levels of both proteins, we were not yet able to verify EVI5 and IPPK as Taspase1 targets. Similarly, we could not yet verify cleavage of full length REV3L by Taspase1 due to failed protein expression. Microinjection of REV3L expression vectors revealed that this is most likely a problem of transcription or protein folding. However, we were able to show that Taspase1 is specific for USF2 by generating a uncleavable protein version USF2mut via SOE-PCR. USF2mut remains intact in the
presence of Taspase1, which is a result similar to co-expression of USF2 with a catalytically inactive Taspase1 mutant. Furthermore, we generated truncated versions of USF2 that resemble the C-terminal (USF2C) and the N-terminal (USF2N) cleavage product, respectively. Using fluorescence microscopy we could demonstrate that USF2C retains its nuclear localization which is in accordance with the presence of an atypical NLS (X. Luo and Sawadogo, 1996b), while USF2N is subject to passive diffusion.We attempted to pinpoint the exact amino acid sequence responsible for the nuclear localization of USF2C via computer-assisted microinjection with unreliable results. In a cell viability assay we demonstrated that transfection of A549 lung carcinoma and HeLa Kyoto Cervix carcinoma cells with expression vectors encoding USF2mut affects cell viability to a much greater extent than USF2C,
but has little effect on non-tumorigenic 293T cells. Also, we showed that overexpression of USF2mut, but not USF2C or wild type USF2, significantly lowers CDK4 protein levels in A549, but not in HeLa Kyoto cells. We provided evidence that proteolysis of USF2 by Taspase1 modulates interaction with its binding partners Upstream Stimulatory Factor 1 (USF1) and Fos-Related Antigen 1 (FOSL1). Co-Immunoprecipitation experiments revealed a reduced interaction strength between USF2mut and USF1, compared to USF2C. Remarkably, we observed an reverse effect on the interaction with the the AP-1 component FOSL1. Utilizing Proximity Ligation Assays we demonstrated that in the presence of wild type Taspase1 interaction between FOSL1 and USF2 is significantly reduced. Proteolysis of USF2 has contrary effects on Heme Oxygenase 1 (HMOX1) promoter-driven reporter gene expression in tumorigenic A549 and non-tumorigenic 293T cells, but shows virtually no impact in HeLa Kyoto cells. In A549 cells overexpression of USF2C
leads to a considerable increase in HMOX1 promoter activity, whereas in 293T
cells USF2mut as well as USF2C increase promoter activity, with USF2mut eliciting a much more prominent response. In HeLa Kyoto cells reporter gene expression was unaffected. In a high-throughput micro array experiment we demonstrated that coexpression of USF2mut with USF1 has pronounced antiproliferative, pro-apoptotic effects in HeLa Kyoto cells compared to USF1/USF2C expression and modulates USF2-related processes, such as fatty acid metabolism. Lastly, we tested five small molecule compounds that were isolated from hops for their inhibitory potential on Taspase1 activity and showed promising results in previous virtual docking experiments
performed by Prof. Dr. Dominik Heider (University of Marburg). However,
due to fluorescence quenching exhibited by each compound and considerable Taspase1 precipitation in the presence of four of the five compounds we did not get evaluable results. The establishment of a novel non-fluorogenic in vitro Taspase1 activity assay that allow for quantification of Taspase1 activity is required. Taken together we have for the first time studied USF2 activity as a function of its proteolytic state and provided evidence that the Taspase1-mediated cleavage of the peptide sequence encoded by exon 4 affects the biological function of USF2, possibly via modulation of the interaction network with co-activators of transcription. We have further emphasized the cell type-dependent function of USF2 that was documented in USF2-related publications and underlined the potential of Taspase1 inhibitors as
novel anti-cancer drugs. IPPK und USF2).

Krebs gehört nach Herzkreislauferkrankungen zu den zweithäufigsten Todesursachen in Europa (Townsend et al., 2016). In 2012 betrafen 2.4 % aller neu aufgetretenen Krebsfälle das blutbildende oder lymphatische System. Insgesamt wurden 2012 12,640 Personen in Deutschland mit Leukämie diagnostiziert, 5 % davon waren jünger als 15 Jahre (Institute, 2012). Zwischen 2008 und 2010 lag die 5-Jahres-Überlebensrate für CML und CLL Leukämien deutschlandweit bei 70 % bzw. 76 %, was bedeutet, dass etwa zwei Drittel aller Patienten ihr Diagnose länger als 5 Jahre überleben. Die Prognose für AML und ALL Patienten ist hingegen sehr viel düsterer. Lediglich 24 % (AML) und 43 % (ALL) aller Patienten überleben
länger als 5 Jahre nachdem ihre Krankheit festgestellt wurde (Nennecke
et al., 2013). Etwa die Hälfte aller ALL- und 10 % aller AML-Leukämien entstehen durch Translokationsereignisse, an denen das MLL Gen beteiligt ist (H. Liu, E. H. Y. Cheng, and J. J. D. Hsieh, 2009). Eines der häufigsten Translokationspartnergene, das in-frame mit MLL fusioniert, ist AF4 (Meyer, Schneider, et al., 2006; Kowarz et al., 2007). AF4-MLL Derivate sind das Ergebnis reziproker T(4;11) Translokationen und tragen maßgeblich zum Krebsphänotyp bei. Die Fusionsproteine werden durch die Endopeptidase Taspase1 gespalten und dadurch aktiviert und stabilisiert (Bursen, Moritz, et al., 2004). Taspase1 spielt jedoch nicht nur in Leukämieerkrankungen eine Rolle. Eine Überexpression wurde in verschiedenen Tumorentitiäten nachgewiesen (D. Y. Chen, H. Liu, et al., 2010; Knauer et al., 2011), was darauf hindeutet, dass Taspase1 in Krebserkrankungen eine zentrale
Rolle spielen könnte. Inhibition von Taspase1 wird daher als potentieller neuer Therapieansatz für die Behandlung verschiedener Krebsentitäten angesehen. Die genaue Rolle die Taspase1 in der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Krebserkrankungen spielt, ist jedoch noch immer unklar, da unser Wissen über Aktivierungsmechanismen, Degradom und wie Taspase1 in tumorerhaltende Signalwege eingebaut ist, stark beschränkt ist. Taspaseinhibition als Behandlungsmethode für Leukämie und andere Krebsarten ist jedoch nur dann sinnvoll, wenn die dadurch ausgelösten Effekte die vitalen Funktionen gesunder Zellen nicht beeinträchtigen. Es ist daher unerlässlich Substrate von Taspase1 zu identifizieren und zu ergründen wie ihre Funktionsweisen durch Proteolyse beeinflusst werden.
Um einige Lücken in unserem Wissen über Taspase1 zu schließen haben wir
versucht einige bona fide Targets, die von (Bier, Knauer, Docter, et al., 2011)
identifiziert wurden, zu verifizieren und charakterisieren (EVI5, REV3L, RbGP1).Wir konnten erfolreich Volllängeversionen von RbGP1, IPPK and REV3L generieren. Aufgrund sehr schwacher Expression von EVI5 und IPPK war eine Evaluation dieser Proteine bezüglich Spaltung durch Taspase1 jedoch nicht möglich. Ebenso konnten wir die Spaltung von Volllänge REV3L aufgrund fehlender Expression nicht verifizieren. Mikroinjektionsexperimente mit Expressionsvektoren die REV3L codieren deuten darauf hin, dass hier ein Problem auf Ebene der Transkription oder Proteinfaltung vorliegt. Wir konnten jedoch zeigen, dass die Taspase1-vermittelte Spaltung von USF2 spezifisch ist, indem wir mittels SOEPCR eine nicht-spaltbare Mutante erstellten (USF2mut), die in Gegenwart von Taspase1 intakt bleibt. Ein vergleichbares Ergebnis wird bei Co-Expression von USF2 mit der katalytisch inaktiven Variante von Taspase1, TaspaseTV, erzielt. Zusätzlich zu USF2mut haben wir verkürzte Versionen von USF2 generiert, die das Cterminale bzw. N-terminale Spaltprodukt darstellen. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnten wir zeigen, dass USF2C nukleär lokalisiert ist, was in Übereinstimmung mit einem atypischen NLS ist, das von (X. Luo and Sawadogo, 1996b) postuliert wurde. USF2N unterliegt aufgrund seiner geringen Größe passiver Diffusion. Mit Hilfe computer-unterstützter Mikroinjektion haben wir versucht die exakte Aminosäuresequenz zu identifizieren, die für den nukleären Import von USF2C verantwortlich ist. Die Ergebnisse dieser Experimente ließen jedoch keine eindeutige Aussage zu. In einem Zellviabilitätsassay konnten wir beobachten, dass USF2mut die Zellviabilität von tumorigenen A549 und HeLa Kyoto Zellen nach Transfektion mit entsprechenden Expressionsvektoren, in größerem Maße beeinträchtigt als USF2C. Hingegen waren bei beiden Konstrukten kaum Auswirkungen in nichttumorigenen 293T zu beobachtet. Wir konnten zudem zeigen, dass die Überexpression von USF2mut, jedoch nicht von USF2C, die Proteinlevel von CDK4 in A549 signifikant verringert. Dieser Effekt war in HeLa Kyoto und 293T Zellen nicht feststellbar. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Taspase1-vermittelte Proteolyse von USF2 sein interaktives Verhalten bezüglich Upstream Stimulatory Factor 1 (USF1) und Fos-Related Antigen 1 (FOSL1) moduliert.
In Co-Immunopräzipitationsexperimenten war eine verringerte Interaktion
zwischen USF1 und USF2mut festzustellen. Interessanterweise konnten wir den gegenteiligen Effekt für die AP-1 Komponente FOSL1 beobachten. In einem Proximity Ligation Assay war die Interaktion zwischen FOSL1 und USF2 in Gegenwart katalytisch aktiver Taspase1 reduziert. Proteolyse von USF2 hat zudem in A549 und 293T Zellen gegenteilige Auswirkungen auf die Expression von Reportergenen, die unter der Kontrolle des Heme Oxygenase 1 (HMOX1) Promoters stehen, während in HeLa Kyoto Zellen praktisch keine Zellantwort zu beobachten ist. In einer Hochdurchsatzmessung mittels Biochip haben wir die Expressionsprofile von HeLa Kyoto Zellen verglichen, die entweder USF2mut/USF1 oder USF2C/USF1 coexprimieren. Wir konnten zeigen, dass die Co-Expression von USF2mut mit USF1 einen deutlichen anti-proliferativen, pro-apoptotischen Effekt hat und Prozesse moduliert,
in denen USF2 eine Rolle spielt, wie z.B. Fettsäuremetabolismus.
Weiters haben wir fünf niedrigmolekulare Substanzen, die aus Hopfen isoliert wurden, in einem FRET-basierten Assay auf Taspaseinhibition getestet. Mindestens eine dieser Substanzen zeigte in Vorversuchen mit Virtual Docking, die von Prof. Dr. Dominik Heider (Universität Marburg) durchgeführt wurden, vielversprechende Ergebnisse. In unserer Messung zeigten jedoch alle Substanzen beträchtliche Fluoreszenzlöschung. Zudem präzipitierte rekombinante Taspase1 in Gegenwart von vier der Substanzen, was die Etablierung eines neuen in vitro Assays erforderlich
macht, der eine Quantifizierung von Taspase1-Aktivität unabhängig von fluorogenen Label zulässt. Eine definitive Evaluation einer möglichen inhibitorischen Wirkung der Hopfensubstanzen auf Taspase1 war daher zu diesem Zeitpunkt nicht möglich.
Zusammenfassend haben wir erstmals die Aktivität von USF2 in Zusammenhang mit Taspase1-vermittelter Proteolyse untersucht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spaltung der Peptidsequenz, die durch Exon 4 codiert wird, die biologische Funktion von USF2 maßgeblich beeinflusst. Dies geschieht vermutlich durch eine Modulation des Interaktionsnetzwerks von Aktivatoren und Co-Aktivatoren der Transkription. Wir konnten zudem die zelltyp-spezifische Funktion von USF2 nachweisen, die in Publikationen zu USF2 erwähnt wird, und das Potential von Taspase1-Inhibitoren als Krebstherapeutika unterstreichen.

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