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Adaptor binding sites in the clathrin terminal domain directly recruit the microtubule-stabilizing protein GTSE1 to the mitotic spindle

Yu-Chih, Lin

Die richtige Mikrotubilistabilität ist sowohl entscheidend für den Aufbau normaler bipolarer Spindeln als auch für die korrekte Ausrichtung der Chromosomen während der Mitose. Clathrin Heavy Chain 17 (CHC) wird, unabhängig von seinen Funktionen während der Interphase, während der Mitose zur Stabilisierung der Mikrotubuli benötigt. CHC interagiert mit dem Protein TACC3, was es dem CHC-TACC3 Komplex dann ermöglicht, sich auf mitotische Spindeln zu verlagern. Eine Mutation in der CHC Terminal Domäne (TD) beeinflusst weder die Interaktion mit TACC3 noch die Spindellokalisierung. Jedoch verursacht diese Mutation Defekte in der Mitose, was darauf hindeutet, dass die CHC TD einzigartige Funktionen während der Mitose ausübt. Hier konnten wir zeigen, dass GTSE1 durch mehrere LIDL Motive, die den Motiven von Clathrinadaptorproteinen ähneln, direkt die CHC TD bindet. Zur Stabilisierung dieses Komplexes werden dabei drei individuelle LIDL Motive benötigt. Mit Hilfe von Röntgenkristallographie konnten wir weitere Einblicke in diese Wechselwirkung in molekularer Auflösung gewinnen. Darüber hinaus ist die direkte Interaktion von CHC mit GTSE1 für die Rekrutierung von GTSE1 und die Lokalisierung an der mitotischen Spindel erforderlich. Mutationen von GTSE1 im Bereich dieser CHC Bindungsmotive führen zur Delokalisation von GTSE1 von der Spindel und Defekten in der Spindelarchitektur, Chromosomenausrichtung und verzögerter Mitose. Zuvor konnten wir GTSE1 als neuartiges Mikrotubuli stabilisierendes Protein identifizieren, das die Depolymeraseaktivität von MCAK inhibiert. In dieser Studie rekonstruierten wir in vitro einen Mikrotubuli stabilisierenden Komplex aus CHC, TACC3, ch-TOG und GTSE1 und konnten zeigen, dass dieser des Weiteren mit MCAK interagieren kann. Demnach ist ein Mechanismus, durch den Spindelmikrotubuli stabilisiert werden, dass GTSE1 von CHC-TD rekrutiert wird und in Folge dessen MCAK inhibieren kann. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass GTSE1 schwach mit dem KMNZ-Netzwerk von Kinetochoren in Abhängigkeit von Phosphorylierung durch Aurora B interagieren kann und dass GTSE1 sich vereinzelt mit MCAK an Kinetochoren kolokalisiert. Diese Rekrutierung könnte zeigen, wie GTSE1 die Aktivität von MCAK an Kinetochoren reguliert, um die korrekte Bindung zwischen Mikrotubuli und Kinetochoren aufrechtzuerhalten.Zusammenfassend haben wir hier gezeigt, dass sich GTSE1 mit Hilfe des CHC-TACC3-Komplexes an Spindeln lokalisiert und durch den KMNZ-Komplex zu den äußeren Kinetochoren rekrutiert wird, wodurch die Aktivität von MCAK in der Mitose global reguliert wird, um eine normale bipolare Spindel und korrekte Bindungen zwischen Mikrotubuli und Kinetochoren zu erreichen.

Proper microtubule stability is crucial to build normal bipolar spindles and align chromosomes correctly during mitosis. Clathrin heavy chain 17 (CHC) is required for microtubule stability during mitosis independent of its functions in interphase. CHC interacts with the protein TACC3, which permits the CHC-TACC3 complex to translocate onto mitotic spindles. A mutant on the CHC terminal domain (TD) affects neither the TACC3 interaction nor their spindle localization. However, this mutant further causes mitotic defects, suggesting that the CHC TD has unique functions during mitosis. Here, we found that GTSE1 binds directly to the CHC terminal domain (TD) via several LIDL-like motifs that resemble motifs in clathrin adaptor proteins for binding the CHC TD. A pair of different interactions with these motifs is required for stabilizing the CHC-GTSE1 complex. Using X-ray crystallography, we further gained insight into this interaction in a molecular resolution. Moreover, its direct interaction with CHC is required for GTSE1’s recruitment to and functions on spindles. GTSE1 mutated at these CHC-binding motifs delocalizes from spindles and leads to defects in the spindle architecture, chromosome alignment and timely mitosis. We previously identified GTSE1 as a novel microtubule-stabilizing protein that inhibits the activity of the microtubule depolymerase MCAK. In this study, we reconstituted a microtubule-stabilizing complex including CHC, TACC3, ch-TOG and GTSE1 in vitro, and this complex can further interact with MCAK. Thus, one mechanism of how the CHC TD stabilizes spindle microtubules is by bringing GTSE1 to inhibit MCAK. Furthermore, we found that GTSE1 could weakly interact with the KMNZ network of kinetochores, dependent on Aurora B phosphorylation, and that GTSE1 occasionally colocalizes with MCAK on kinetochores. This recruitment might imply how GTSE1 regulates MCAK activity on kinetochores to maintain the proper microtubule-kinetochore attachment. In summary, here we showed that GTSE1 localizes on spindles via the CHC-TACC3 complex and is recruited to the outer kinetochores through the KMNZ complex, which globally regulates MCAK activity in mitosis to achieve a normal bipolar spindle and proper microtubule-kinetochore attachment.

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Yu-Chih, Lin: Adaptor binding sites in the clathrin terminal domain directly recruit the microtubule-stabilizing protein GTSE1 to the mitotic spindle. 2018.

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