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Die Rolle der humanen Serinprotease HTRA1 in der Regulation von Zellzyklus und Apoptose

Schillinger, Jasmin

Die humane Serinprotease HTRA1 steht mit vielen verschiedenartigen Erkrankungen in Verbindung. Ein Verlust von HTRA1 bzw. der HTRA1 Aktivität wird beispielsweise in diversen Tumorerkrankungen und der Erbkrankheit CARASIL beschrieben. Beobachtete pleiotrope Phänotypen von Zellen mit verringerter HTRA1 Expression beinhalten ein verstärktes Zellwachstum, Zentrosomen Amplifikationen und Polyploidie. Diese Beobachtungen deuten auf wichtige Funktionen von HTRA1 in regulatorischen Prozessen hin. Die Expression des HTRA1 Gens ist in vielen Tumorarten negativ reguliert. Ein in vivo Experiment in K‑ras mutierten aggressiven Tumor-Mausmodellen zeigte jedoch, entgegen des bis dahin postulierten tumorsuppressiven Einflusses von HTRA1, einen protektiven Effekt eines Htra1 Knockouts in Abhängigkeit der K-ras Mutation. Darüber hinaus wurden die Kinasen B‑RAF und C‑RAF in einem PDZ-optimierten Peptidscreen als potentielle HTRA1 Liganden identifiziert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde deshalb die Interaktion von HTRA1 mit dem ERK-Signalweg in humanen Kolonkarzinomzellen (SW480) analysiert, die stabil verschiedene Level von HTRA1 exprimierten. Dabei konnte eine Interaktion von HTRA1 und C-RAF in den Lysaten von SW480 Zellen, sowie die Bildung eines Komplexes aus rekombinantem HTRA1 und der RAS-Bindedomäne (RBD) von C-RAF in vitro nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation der Proteine in humanen Zellen scheint nach einer Analyse der Zellen mittels konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie möglich. Außerdem wurde die RBD von C-RAF als ein in vitro Substrat von HTRA1 identifiziert. Ein Effekt von HTRA1 auf die Aktivität des ERK-Signalweges konnte in Western-Blot Analysen mit phospho-spezifischen Antikörpern nicht beobachtet werden. Um neue Funktionen und Interaktionspartner von HTRA1 in regulatorischen Prozessen der Zelle zu identifizieren, wurde eine Proteom-Analyse von SW480 Zellen durchgeführt, die in distinkten Zellzyklusphasen synchronisiert waren. Die Ergebnisse der Proteom-Analyse deuten auf Funktionen von HTRA1 in Mikrotubuli-assoziierten Prozessen, dem G2-DNA damage checkpoint, der DNA Replikation bzw. des DNA-Licensing und der Apoptose hin. Des Weiteren wurde für eine Reihe von Proteinen wie Calpaine, Annexine und MCMs eine bisher unbekannte, Zellzyklus abhängige Regulation beobachtet. Neben anderen potentiellen Interaktoren, wurde das Calcium‑bindende Protein Annexin A1 als bisher unbekanntes HTRA1 Substrat identifiziert. Diese Vermutung konnte in einer Western-Blot Analyse von SW480 Zelllysaten und einem in vitro Enzym-Assay bestätigt werden. Da sowohl für HTRA1 als auch für Annexin A1 pro- und anti-apoptotische Funktionen beschrieben wurden, wurde der Effekt von HTRA1 auf die Induktion von Apoptose in SW480 Zellen analysiert. Eine Untersuchung der Zellen mittels Durchflusszytometrie ergab, dass Zellen mit verminderter HTRA1 Menge eine höhere Anzahl sterbender Zellen nach Behandlung mit 5-Fluorurazil aufwiesen, als die anderen Zelllinien. Der induzierte Zelltod war zu einem Teil abhängig von der Aktivität zellulärer Caspasen. Darüber hinaus wurden vier klinisch relevante HTRA1 Mutanten aus CARASIL auf ihre Aktivität und ihren oligomeren Zustand untersucht. Enzym-Assays zeigten eine verminderte oder fehlende proteolytische Aktivität aller vier Mutanten. Die analytische Größenausschlusschromatographie und Crosslink-Experimente zeigten, dass der Verlust der proteolytischen Aktivität auf einen Assemblierungsdefekt der Mutanten zurückzuführen war. Die Ergebnisse dieser in vitro Analyse legen dar, dass auch Mutationen außerhalb der Proteasedomäne über einen Assemblierungsdefekt zu einer Inaktivierung von HTRA1 führen können. Die Aktivität einer Mutante (R166H) konnte durch Zugabe eines Peptid-Liganden beispielhaft um 40 % restauriert werden. In der monogenetischen Erkrankung CARASIL stellt HTRA1 ein logisches Ziel proteinbasierter Therapien dar. Zusätzlich würde die Wiederherstellung der HTRA1 Aktivität durch Methoden der supramolekularen Chemie einen wichtigen Beitrag für das neue Feld der Proteinreparatur leisten.

The human serine protease HTRA1 is implicated in several severe pathologies. The loss of HTRA1 or the HTRA1 activity, respectively, is associated with different types of cancer and the hereditary CARASIL disease. Cells with a reduced HTRA1 expression show pleiotropic phenotypes like an increased proliferation, centrosome amplifications and polyploidy. These features suggest an important function of HTRA1 in regulatory processes of the cell. The expression of the HTRA1 gene is downregulated in many types of human tumors. An in vivo experiment in K-ras mutated aggressive tumor mouse models, however, showed a protective effect of an Htra1 knockout according to the K-ras mutation. These results contrast with the so far postulated tumor-suppressive function of HTRA1. In addition, B-RAF and C-RAF kinases were identified as potential HTRA1 ligands in a PDZ-domain optimized peptide screen with recombinant HTRA1. Therefore, the possible interaction of HTRA1 and the ERK signal transduction pathway was analyzed in human colon carcinoma cells (SW480). These cells stably expressed varying levels of HTRA1. In lysates of SW480 cells an interaction of HTRA1 and C-RAF was observed. Moreover, the formation of a complex of recombinant HTRA1 and the RAS-binding domain (RBD) of C-RAF was identified in vitro. A colocalization of both proteins seems possible after analysis in SW480 cells with confocal laser scanning microscopy (CLSM). In addition, the RBD of C-RAF was identified as a novel in vitro substrate of HTRA1. An effect of varying HTRA1 levels on the activity of the ERK signal transduction pathway could, however, not be observed by western blotting analysis with phospho‑specific antibodies. To identify new functions and interactors of HTRA1 in cellular processes, a whole proteom analysis of SW480 cells, synchronized in all cell cycle phases, was performed. The results of this analysis suggest possible functions of HTRA1 in mictrotubule associated processes, the G2-DNA damage checkpoint, DNA replication and DNA licensing, respectively, and in apoptosis. Moreover, for some proteins like calpains, annexins and MCMs a so far unknown cell cycle dependent regulation was described. Besides other potential interactors the calcium binding protein annexin A1 was identified as a potential HTRA1 substrate, which was confirmed via a western blot analysis and in vitro enzyme assay. As pro- and anti-apoptotic functions were reported in previous studies for HTRA1 and annexin A1 both, the effect of HTRA1 on induction of apoptosis was analyzed in SW480 cells. A flowcytometric analysis of SW480 cells with varying HTRA1 levels revealed that cells with reduced HTRA1 levels show higher amounts of dying cells after a 5-fluorouracil treatment than the other cell lines. The cell death induced was at least partially dependent on the activity of cellular caspases. In addition to the effects of HTRA1 on cellular signaling and apoptosis, the analysis of clinically relevant HTRA1 mutations identified in CARASIL was another focus of this work. Four mutated recombinant variants of HTRA1 were tested for their activity and oligomeric state and compared to the wildtype protein. Enzyme assays showed a reduced or no proteolytic activity for all mutants tested. Analytic size exclusion chromatography and crosslink experiments showed that this loss of activity was due to an assembly defect of the mutated proteins. The results of this in vitro study suggest that clinically relevant CARASIL mutations which are located outside of the protease domain of HTRA1 can reduce the protease activity by causing an assembly defect of the HTRA1 trimer. The activity of HTRA1(R166H) was exemplarily restored upon 40 % by the addition of a peptide ligand. As CARASIL is a monogenetic disease HTRA1 displays a logical target for protein based therapies. Moreover, the restauration of the HTRA1 activity by methods of supramolecular chemistry could contribute to the new field of protein repair.

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Schillinger, Jasmin: Die Rolle der humanen Serinprotease HTRA1 in der Regulation von Zellzyklus und Apoptose. 2018.

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