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Synthese von maßgeschneiderten thiolierten Raman-Farbstoffen für den Einsatz in der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie

Brem, Svetlana

Plasmonisch-aktive Gold- und Silbernanopartikel (AuNP & AgNP) mit maßgeschneiderten Raman- Farbstoffen auf Basis von Rhodaminen und Polyenen sind von Interesse und Wichtigkeit für die Bioanalytik mit Hilfe der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS). In dieser Dissertation wurden neue maßgeschneiderte Raman-Farbstoffe synthetisiert, charakterisiert und auf ihre SERS-Aktivität getestet. Die Raman-Reporter müssen trifunktionell sein und Kriterien, wie großer Raman-Streuquerschnitt, Thiolgruppen für die Chemisorption auf einer Metalloberfläche und Carbonsäure- oder Ester- Gruppen für eine nachfolgende Biokonjugation, erfüllen. Rhodamin 6G wird für viele SERS-Anwendungen wegen des großen Streuquerschnittes und des dazugehörigen starken SERS-Signals eingesetzt. Jedoch lässt sich das Adsorptionsverhalten von diesem kationischen Farbstoff schwer kontrollieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das thiolierte Rhodamin 4-(3,6-Diamino-4,5-dimercapto- 9H-xanthen-9-yl)-isophthalsäure (1, CRhSH), ausgehend von 5,6-Carboxyrhodamin (2, CRh), in einer mehrstufigen Synthese erfolgreich synthetisiert. Die Einführung von Thiolgruppen erfolgte direkt am Chromophor um gute Bedingungen für eine Interaktion von Nanopartikelmetalloberfläche und dem Raman-Reporter 1 zu schaffen. Raman-Bandenzuordnungen für 1 und 2 konnten mit Hilfe von computer-chemischen Rechnungen (DFT) durchgeführt werden. Das Adsorptionsverhalten von 1 und 2 wurde an polydispersen Au-Nanosternen mittels Elektronenmikroskopie (TEM/REM) und SERS untersucht. Die erhaltenen SERS-Spektren von 1 und 2 in kolloidaler Suspension (Ensemble), sowie auf Einzelpartikelniveau, waren reproduzierbar. Weitere SERSSubstrate, wie AuNP auf Siliziumoberflächen (AuNP@Si) und AuNP auf Au-Filmen (AuNP@Au), wurden ebenfalls erfolgreich zur Untersuchung der SERS-Spektren von CRhSH (1), CRh (2) und Rhodamin 6G verwendet. Parallel zur Rhodamin-Klasse wurden thiolierte Polyene synthetisiert. Diese Klasse von Raman- Farbstoffen eignet sich aufgrund ihrer zu plasmonischen Metalloberflächen affinen Thiolgruppen und ihres einfachen Raman-Bandenmusters besonders gut für SERS-Anwendungen. Es wurde die vinylischen linearen Polyene Ethyl-(2E,4E)-5-(acetylthio)penta-2,4-dienoat (29), Ethyl-(2E,4E, 6Z)-7-(acetylthio)hepta-2,4,6-trienoat (30), Ethyl-(2E,4E)-5-(tert-butylthio)penta-2,4-dienoat (33) und Ethyl-(2E,4E,6E)-7-(4-(tert-butylthio))hepta-2,4,6-trienoat (34), sowie die phenylischen linearen Polyene Ethyl-(2E,4E)-5-(4-tert-butylthio)phenyl-penta-2,4-dienoat (39), Ethyl-(2E,4E,6E)-7- (4-(tert-butylthio)phenyl)hepta-2,4,6-trienoat (40), Ethyl-(2E,4E,6E,8E)-9-(4-(tert-butylthio)phenyl) nona-2,4,6,8-tetraenoat (41) und Ethyl-(2E,4E,6E,8E,10E)-11-(4-(tert-butylthio)phenyl)undeca-2, 4,6,8,10-pentaenoat (42) mittels Kettenverlängerung in einer DIBAL-H Reduktion in Kombination mit Mangan(II)-oxid-Oxidation & Wittig-Reaktion in situ erfolgreich synthetisiert. Bei der Entwicklung der Synthesen von 29 und 30 konnte gezeigt werden, dass die Einführung von Thiolgruppen besonders im letzten Syntheseschritt erfolgreich durchgeführt werden kann. Außerdem konnte durch die tert-Butyl-Schutzgruppe am Schwefel mehr Stabilität der Polyenkette erreicht werden, wodurch die Polyene 33 und 34 synthetisiert werden konnten. Für längerkettige Polyene musste ein terminaler Phenylring eingeführt werden, um eine Polymerisation zu verhindern. In konzentrationsabhängigen Raman-Experimenten wurde gezeigt, dass für die Aufnahmen eines Raman-Spektrums von 29 nur ein Fünftel der Konzentration von 4-Mercaptobenzoesäure (4-MBA) benötigt wird. Somit erwiesen sich die vinylischen linearen Polyene mit zwei oder drei Doppelbindungen als bessere Raman-Reporter im Vergleich zu 4-MBA. Die SERS-Aktivität von 29 und 30 wurde mit Gold-Nanosternen, Gold/Silber-Nanoschalen und super-spärischen Goldnanopartikeln auf Goldfilmen (AuNP@Au) getestet. Die Adsorption der vinylischen Polyen-Raman-Reporter erfolgte offensichtlich über die Gold-Schwefel-Bindung, da die Raman-Mode bei 821 cm-1 (C-S-Schwingung) verstärkt detektiert werden konnte. Die tert-Butylgeschützten Polyene (z.B. 33 und 34) adsorbierten bereits so auf der Gold-Nanopartikeloberfläche, während 29 und 30 erst nach der Entschützung der Schwefelgruppe adsorbierten. In jedem Fall konnten für alle Polyen-Nanopartikelkompositionen reproduzierbare SERS-Spektren gemessen werden. Zur Untersuchung des Adsorptionsverhaltens von phenylischen thiolierten Polyenen 39, 40, 41 und 42 wurden Au-Nanosterne verwendet. Für das Polyen mit zwei Doppelbindungen 39 wurde fast doppelt so viel Signal wie für Polyen 42 gemessen. Für die Polyene 40, 41 und 42 wurden vergleichbare SERS-Signale detektiert. Die Signalintensitäten von Raman-Reportern (Rhodamine, Polyene) konnten insgesamt nur schwierig quantitativ verglichen werden, da die Konzentration der Nanopartikel schwankte und verschiedene Geometrien der Nanopartikel (Nanosterne, Nanopartikeldimere oder Oligomere) verschieden starke hot spot-Intensitäten erzeugten. Insgesamt sind die in dieser Arbeit vorgestellten Raman-Reporter für Raman- und SERS-Anwendungen und darüber hinaus vielseitig einsetzbar und daher attraktiv. Die Kettenlänge eines thiolierten Polyens kann beliebig variiert und somit der gewünschten Wellenlänge angepasst werden. Rhodamine können durch Einsatz verschiedener funktioneller Gruppen ebenfalls wellenlängenund oberflächenchemisch-abhängig angepasst werden. Aufgrund der spektralen Unterschiede sind die tert-Butyl-geschützten monothiolierten Polyene 33, 34, 39, 40, 41 und 42 für Mehrfarben- Multiplexing-Experimente in der SERS-Spektroskopie aufgrund ihrer spektralen Schmalbandigkeit besonders gut geeignet. Basierend auf den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen konnte die Synthese von neuen thiolierten Rhodaminen und längerkettigen mono- und dithiolierten Polyenen deutlich verbessert werden und deren Anwendung als Raman- und SERS-Farbstoffe prototypisch erfolgreich gezeigt werden.

Plasmonically active gold and silver nanoparticles (AuNPs and AgNPs) with rationally designed Raman dyes based on rhodamines and polyenes are of interest and importance in Bioanalytics using surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). In this dissertation, new Raman dyes were synthesized, characterized and tested for their SERS activity. The trifunctional Raman dyes (Raman reporters) must fulfill some criteria: large Raman scattering cross section, thiol groups for chemisorption on a metal surface, and carboxylic acid or ester groups for further bioconjugation. Rhodamine 6G is used for many SERS applications because of the large scattering cross-section and the corresponding strong SERS signal. However, the adsorption behavior of this cationic dye is difficult to control. For this reason the thiolated rhodamine 4-(3,6-diamino-4,5-dimercapto-9H-xanthen-9-yl)isophthalic acid (1, CRhSH) startet from 5,6-carboxyrhodamine (2, CRh) was successfully synthesized in a multistep synthesis. The thiol groups were introduced directly at the chromophore to create good conditions for the interaction of nanoparticle metal surface and the Raman reporter 1. Raman band assignments for 1 and 2 could be performed using computer-chemical calculations (DFT). The adsorption behavior of 1 and 2 was investigated on polydisperse Au nanostars by electron microscopy (TEM/SEM) and SERS. The obtained SERS spectra of 1 and 2 in colloidal suspension (ensemble), as well as on the single particle level, were reproducible. Further SERS substrates, such as AuNP on silicon wafer (AuNP@Si) and AuNP on Au films (AuNP@Au), have also been successfully used to investigate the SERS spectra of CRhSH (1), CRh (2) and rhodamine 6G. Parallel to the rhodamines thiolated polyenes were also synthesized. This class of Raman dyes is particularly well suited for SERS applications due to its thiol groups affinity to plasmonic metal surfaces and its simple Raman spectra. The vinylic linear polyenes Ethyl-(2E,4E)-5-(acetylthio)penta- 2,4-dienoate (29), Ethyl-(2E,4E,6Z)-7-(acetylthio)hepta-2,4,6-trienoate (30), Ethyl-(2E,4E)-5-(tertbutylthio) penta-2,4- dienoate (33) und Ethyl-(2E,4E,6E)-7-(4-(tert-butylthio))hepta-2,4,6-trienoate (34), and phenylic linear polyenes Ethyl-2E,4E)-5-(4-tert-butylthio)phenyl-penta-2,4-dienoate (39), Ethyl-(2E,4E,6E)-7-(4-(tert-butylthio)phenyl)hepta-2,4,6-trienoate (40), Ethyl-(2E,4E,6E,8E)-9-(4- (tert-butylthio)phenyl)nona-2,4,6,8-tetraenoate (41) und Ethyl-(2E,4E,6E,8E,10E)-11-(4-(tert-butyl thio)phenyl)undeca-2,4,6,8,10-pentaenoate (42) were successfully synthesized by chain extension in a DIBAL-H reduction in combination with manganese dioxide oxidation & Wittig reaction. In the development of the syntheses of 29 and 30 it was shown that the introduction of thiol groups can be carried out successfully in the last synthesis step. In addition, more stability of the polyene chain could be achieved by the tert-butyl protective group at the sulfur, whereby the polyene 33 and 34 could be synthesized. For longer chain polyenes, a terminal phenyl ring had to be introduced to prevent polymerization. In concentration-dependent Raman experiments, it was shown that only one-fifth of the concentration of 4-mercaptobenzoic acid (4-MBA) is required for recording a Raman spectrum of 29. Thus the vinylic linear polyenes with two or three double bonds proved to be better Raman reporters compared to 4-MBA. The SERS activity of 29 and 30 was tested with gold nanostars, gold/silver nanoshells and super spherical gold nanoparticles on gold films (AuNP@Au). The adsorption of the vinylic Raman reporter was evidently due to the gold-sulfur bond, since the enhanced Raman-mode at 821cm-1 (C-S vibration) could be detected. The tert-butyl-protected polyenes (for example 33 and 34) already adsorbed on the gold nanoparticle surface, whereas 29 and 30 adsorbed only after deprotection of the sulfur. In each case, reproducible SERS spectra could be measured for all polyene nanoparticle composites. To investigate the adsorption behavior of phenylic thiolated polyenes, Au nanostars were used. For the polyene with two double bonds 39 almost two time more signal was measured as for polyene 42. For the polyenes 40, 41 and 42 comparable SERS signals were detected. The signal intensities of Raman reporters (rhodamines, polyenes) are difficult quantitatively to compare, since the concentration of the nanoparticles fluctuated and different geometries of the nanoparticles (nanostars, nanoparticle dimers or oligomers) produced different hot spot intensities. Overall, the Raman reporters presented in this work for Raman and SERS applications and also versatile and therefore attractive. The chain length of a thiolated polyene can be arbitrarily varied and thus adapted to the desired wavelength. Rhodamines can also be adapted by using various functional groups as well as depending on their wavelength and surface chemistry. Because of the spectral differences, the tert-butyl-protected monothiolated polyenes 33, 34, 39, 40, 41 and 42 are particularly suitable for multiplexing experiments in SERS spectroscopy because of its spectral narrow bands. Based on the results obtained in this thesis, the synthesis of novel thiolated rhodamines and long chain mono- and dithiolated polyenes has been significantly improved and their application as Raman and SERS dyes could be demonstrated prototypically.

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Brem, Svetlana: Synthese von maßgeschneiderten thiolierten Raman-Farbstoffen für den Einsatz in der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie. 2017.

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