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Tailored protein encapsulation into a DNA host using geometrically organized supramolecular interactions

Sprengel, Andreas LSF

During this PhD project, aspects of DNA nanotechnology, biology and supramolecular chemistry have been merged. This work can be divided into three main parts: (i) the design of a suitable tubular DNA cage, which is able to encapsulate all different oligomers of DegP; (ii) the synthesis of a DNA-hepta-peptide conjugate, which binds non-covalently to the PDZ1 domain of the target protein and (iii) the loading of the protein. The DNA origami cage was successfully designed and realized as a single-layer hexagonal DNA prism with an inner radius of 20 nm and an outer radius of 23 nm. Using special spatial staples strands for the face-to-face connections, the orientation of the faces towards the cavity could be programmed (6p120 and 6p240). Alternatively, stochastically oriented faces (6p180) were obtained using three thymines as flexible hinges (see chapter 3.2.1 and 3.2.2). Additionally, each face was equipped with zero, one, two or three orthogonal protruding arms (for a total of 0cA1, 6cA1 or 18cA1 arms, respectively). These arms were used for hybridization with DNA-peptide conjugates equipped with optional fluorophores (chapter 3.3). Correct formation of the different designs (6p120, 6p180 and 6p240) was proven by AFM and gel electrophoresis, after adding streptavidin to the biotinylated ligands. TEM characterization (performed by Pascal Lill at the MPI in Dortmund) and dynamic light scattering confirmed the correct dimensions of the DNA structures in solution. The peptide sequence DPMFKLV was synthesized via solid phase peptide synthesis under standard coupling conditions. Transforming the N-terminal amino group of the peptide directly into a maleimide function allowed reaction with the thiol group of an oligonucleotide without the use of any crosslinking agents. This successful method represents a general method to link the terminal amino-group of a peptide to a thiol bearing oligonucleotide. Purification via HPLC allowed characterization of the DNA-DPMFKLV ligands per MALDI-TOF. Loading of diverse DegP proteins (compare chapter 3.1, table 1) only took place in the presence of the A1-DPMFKLV ligands, demonstrating the validity of the encapsulation strategy (compare chapter 3.4.3). Successful and specific binding was shown at the single-molecule level using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, (performed by AG Birkedal, Aarhus University). Statistical evaluation of AFM images revealed preferential encapsulation of the DegP12 protein, with a ratio of 1.3 : 2.2 : 1 for the DegP6, DegP12 and DegP24, respectively. Loading experiments performed with DegP6A633SA and cages with a different number of PAs (see chapter 3.4.3.5) and a correspondingly different number of A1-peptide ligands, showed that one A1-DPMFKLV ligand is sufficient for encapsulation of the protein, with a loading efficiency proportional to the number of ligands. DNA origami cages with identical number of ligands but different orientations of the PAs (6p120, 6p180 and 6p240, see chapter 3.4.3.4) were loaded with DegP12/24A488SA. Gel electrophoresis analysis showed a highest binding efficiency for the 6p120 design in a ratio of 8 : 1.4 : 1 for the 6p120-, 6p180- and 6p240-designs, respectively, thus indicating the importance of a high local concentration of peptide ligands. After successful encapsulation of the protein, experiments to release the protein from the cage were performed, using single strand displacement reactions. Disappearance of the fluorophore signals from the cage sample showed successful displacement of the ligands; however, without releasing the protein. Variation of the pH of the solution and its ionic strength did not result in any beneficial effects (see chapter 3.4.3.8). To sum up, it could be shown that a protein can be encapsulated within a DNA origami cage by weak non-covalent supramolecular interactions without any previous chemical treatment of the protein. The arrangement of a distinct number of peptide ligands in the vicinity of the corresponding binding sites on the protein surface allowed modulation of local concentration effects and multivalent short-range interactions in a single system. The importance of the net charge of the protein for encapsulation within the cavity of the DNA nanochamber and the different binding efficiencies observed for distinct fluorophores, require further investigation. Evidence for the important role of the net charge is the successful loading of the DegP12 protein in presence of molecular tweezers, targeting the lysine residues on the surface of the protein. Results of analogue experiments performed with a second DNA cage, (HoneyComb design, see chapter 1.2.3) are shown in chapter 8.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene Aspekte der DNA-Nanotechnologie, Biologie und der supramolekularen Chemie miteinander verknüpft und zur Anwendung gebracht. Die Arbeit kann in drei Teilbereiche unterteilt werden: (i) Das Designen eines geeigneten hexagonalen turbularen DNA-Käfigs mittels der Software CaDNAno2, dessen räumliche Dimensionen zur Immobilisierung des Proteins DegP in seinen unterschiedlichen Oligomerisierungs-Zuständen entsprechen musste. (ii) (ii) Die Synthese eines Oligonukleotid-Heptapeptid-Konjugates, welches supramolekular an die PDZ1 Domäne des Zielproteins bindet. (iii) (iii) Das Laden des Proteins in den Käfig mit anschließendem Versuch der gerichteten Freisetzung des Proteins. Der DNA-Origami-Käfig wurde mittels der Software CaDNAno2 als einlagiges, turbuläres und hexagonales DNA-Röhrchen mit einem inneren Radius von 20 nm und einem äußeren Radius von 23 nm entworfen und erfolgreich realisiert. Die einzelnen Seitenwände des Käfigs wurden durch jeweils speziell entworfene Oligonukleotide miteinander verknüpft, so dass zum einen die Orientierung der Seitenflächen zum Zentrum der Kavität (6p120 und 6p240) determiniert werden konnte, (vgl. Kapitel 3.2.1 und 3.2.2) und zum anderen durch eine flexible Verbindung der Seitenflächen mittels drei Thyminen eine zufällige Orientierung (6p180) der Seitenflächen zum Zentrum der Kavität vorlag. Zusätzlich wurde jede Seitenfläche mit der Option entworfen, mit null, ein, zwei oder drei (insgesamt 0cA1, 6cA1 oder 18cA1) orthogonal herausragenden Oligonukleotiden (Protruding-Arme), die als Verlängerung von zentral liegenden Oligonukleotiden zu sehen sind, ausgestattet zu werden. Die Protruding-Arme dienen als Träger für die mit Peptiden modifizierten komplementären Oligonukleotid-Liganden (Kapitel 3,3), welche wahlweise mit Fluorescein (Flc-A1-DPMFKLV) oder TAMRA (TAMRA-A1-DPMFKLV) ausgestattet waren. Mittels eines Biotin-modifizierten Liganden konnte durch Zugabe von Streptavidin die korrekte Formation der Konstrukte 6p120, 6p180 und 6p240 durch Gel-Elektrophorese und Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM) bestätigt werden. Messungen durch das Transmissions-Elektronen-Mikroskop (durchgeführt von Pascal Lill am MPI in Dortmund im Rahmen seiner Masterarbeit) und der dynamischer Lichtstreuung bestätigten ebenfalls die korrekte Formation in Lösung. Unter Berücksichtigung des antiproportionalen Verhältnisses der Diffusionsrate durch den Käfig zur Größe des Proteins wurde der DNA-Origami-Komplex so geplant, dass das 12-mer des Proteins DegP bevorzugt binden sollte. Die Synthese des Peptidfragmentes der Liganden erfolgte mittels Festphasenpeptidsynthese nach Standardbedingungen. Die N-terminale Aminogruppe der Peptidsequenz konnte direkt in eine Maleimide Funktion überführt werden (Kapitel 6.5.2.8.2). Ohne die Verwendung eines üblichen Crosslinkers konnten Thiol-modifizierte Oligonukleotide über eine kovalente Bindung an das Maleimid gebunden werden. Dieser erfolgreich etablierte Weg stellt somit eine universelle Methode dar, N-terminale Peptide direkt an Thiol-modifizierte Oligonukleotide zu binden. Eine Charakterisierung der Konjugate erfolgte anschließend mittels MALDI-TOF. Das Laden diverser DegP Protein-Varianten (vgl. Kapitel 3.1, Tabelle 1) erfolgte nur in Anwesenheit des Peptid-Liganden (vgl. Kapitel 3.4.3), was die Selektivität der Methode erfolgreich demonstrierte und unspezifische Wechselwirkungen ausschloß. Das spezifische und erfolgreiche Binden an die DNA-Nano-Käfige konnte mittels interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie durch Überlagerung der Fluoreszenzsignale in Einzelmolekül-Experimenten bestätigt werden (durchgeführt durch die AG Birkedal, Aarhus Universität). Nach statistischer Auswertung der AFM-Bilder konnte gezeigt werden, dass eine Präferenz zur Immobilisierung von 12-meren im Verhältnis 1 : 2.2 : 1.3 für DegP6, DegP12 und DegP24 vorlag, was der Zielsetzung bezüglich der Selektivtät entsprach. Durch das Assemblieren eines 6p120 Käfigs mit einer unterschiedlichen Anzahl an Protruding-Armen (vgl. Kapitel 3.4.3.5) und dementsprechend mit einer unterschiedlichen Anzahl von Liganden konnte gezeigt werden, dass zum einen ein Ligand ausreicht, um ein Protein (DegP6) erfolgreich zu immobilisieren und zum anderen ein proportionales Verhältnis zwischen Ladungseffiziens und der Anzahl der Protruding-Arme besteht. Um den positiven Effekt einer hohen lokalen Konzentration der Peptid-Liganden auf die Bindeeffiziens der Proteine zu zeigen, wurden die DNA-Käfige mit den jeweiligen Ausrichtungen der Protruding-Arme (6p120, 6p180 und 6p240, vgl. Kapitel 3.4.3.4) und gleicher Anzahl der Liganden mit DegP12/24A488SA versetzt und mittels eines Vergleiches der Intensität des Fluorescein-Signals die höchste Bindeeffiziens im Verhältnis 8 : 1.4 : 1 (6p120: 6p180 : 6p240) für die Käfige mit nach innen-orientierten Liganden bestimmt. Nach dem erfolgreichen Immobilisieren des Proteins innerhalb der Kavität des Käfigs wurde anschließend eine Freisetzung des Proteins durch einen Austausch des zum Protruding-Arm nicht vollständig komplementären, mit Fluorophoren markierten Peptid-Liganden durch ein vollständig komplementäres Oligonukleotid versucht. Der erfolgreiche Austausch der markierten Liganden konnte mittels Gel-Elektrophorese gezeigt werden, jedoch nicht unter vollständiger Freisetzung des Proteins. Eine verbesserte Freisetzung konnte trotz Änderung der Nettoladung des Proteins ebenfalls nicht erreicht werden (vgl. Kapitel 3.4.3.8). Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass zum ersten Mal ein Protein durch schwache supramolekulare Interaktionen innerhalb einer DNA-Origamistruktur immobilisiert werden konnte. Diese Proteine konnten ohne chemische Veränderung nur aufgrund der räumlichen Nähe der Peptid-Liganden, die an die PDZ1-Domänen der Proteine bindeten, und der hohen lokalen Konzentration innerhalb der Kavität durch multivalente Wechselwirkungen mit geringer Reichweite im Käfig gehalten werden. Die Bedeutung der Oberflächenladung der Proteine für die Immobilisierung innerhalb der Kavität bedarf noch weiterer Untersuchungen. Ein Indiz für diese Bedeutung liefern die Versuche mit dem molekularen Tweezer, welche an die Lysine an der Oberfläche der Proteine bindet und deren positive Ladung abschirmt. Folglich führt dies zur Abschwächung der unspezifischen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und dem Käfig, so dass diese erfolgreich geladen werden konnten. Die analogen Ergebnisse der Experimente mit einer weiteren Struktur eines offenen Prismas im HoneyComb-Design (vgl. Kapitel 1.2.3) werden in Kapitel 8 gezeigt, da diese keine neuen, bzw. nur die bisherigen Ergebnisse bestätigende Resultate erbracht haben.

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Sprengel, Andreas: Tailored protein encapsulation into a DNA host using geometrically organized supramolecular interactions. 2017.

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