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Charakterisierung der putativen Promotorregion einer Variante der ß-Untereinheit der humanen Farnesyltransferase

Stelmach, Patrick LSF

Die humane Farnesyltransferase steht im Fokus intensiver onkologischer und anderer pathophysiologischer Forschung. Das Enzym überträgt eine Farnesylgruppe auf Proteine, wodurch sich diese an die Zellmembran anheften und so ihre Funktion innerhalb von Signalkaskaden wahrnehmen können. Hemmstoffe der Farnesyltransferase zeigten zwar im Tiermodell große Erfolge, ihr Einsatz bei Malignomen des Menschen verlief allerdings bislang wenig erfolgreich. Um eine Optimierung zu erreichen sind weitere Erkenntnisse über die Regulation und Funktion der Farnesyltransferase essentiell. Das Enzym besteht aus einer α- und einer ß-Untereinheit. Bachmann et al. konnten zeigen, dass neben der bekannten FNTB-F1-Variante, mindestens vier weitere Varianten der ß-Untereinheit existieren. Da über die Regulation dieser Varianten bislang nichts bekannt ist, war das Ziel dieser Arbeit die Promotorregion einer dieser Varianten zu charakterisieren (FNTB-F2). Es wurde ein Bereich von ca. 2000 bp vor dem Translationsstartpunkt der FNTB-F2-Variante als Promotorregion der FNTB-F2-Variante identifiziert. Dieser Bereich weist signifikante basale Promotoraktivität in HEK-293-Zellen auf, wobei der Hauptaktivitätsbereich auf einen DNA-Abschnitt von ca. 300 bp unmittelbar vor dem Translationsstartpunkt lokalisiert werden konnte. Die Kernpromotorregion umfasst einen Bereich von ca. 500 bp vor dem Translationsstartpunkt. Diese Region ist essentiell für die basale Promotoraktivität. In dieser Region befinden sich sechs promotortypische Elemente und der experimentell ermittelte Haupttranskriptionsstartpunkt ist direkt am Beginn dieses Bereiches lokalisiert (zwischen -519 und -488 bp). Der Transkriptionsfaktor HNF1α wurde als regulatorischer Faktor der FNTB-F2-Variante identifiziert. Von 12 in silico vorhergesagten HNF1α-Bindungsstellen innerhalb der untersuchten FNTB-F2-Promotorregion konnten drei Bindungsstellen bei -402/-426, -972/-996 und -979/-1003 mittels EMSA bestätigt werden. Unter Stimulation mit diesem Faktor zeigte sich zudem in HEK-293-Zellen eine bis zu 7-fache Erhöhung der Promotoraktivität. Es gelang die Beschreibung des FNTB-F2-Promotors und die Identifizierung sowie anschließende Evaluierung des funktionellen Einflusses des spezifischen Transkriptionsfaktors HNF1α auf die Promotoraktivität. Die Ergebnisse können als Grundlage für weitere klinische Forschungen dienen. Insbesondere aufgrund der gezeigten relevanten Abhängigkeit der FNTB-F2-Promotoraktivität vom Transkriptionsfaktor HNF1α könnte in Zukunft auch bei weiteren Erkrankungen Hinweise für eine mögliche Bedeutsamkeit der FNTB-F2-Variante aufgedeckt werden. Ähnlich wie dies in dieser Arbeit bereits für den MODY Diabetes, Typ 3 aufgezeigt werden konnte.

The human farnesyltransferase is in focus of intensive cancer- and other pathophysiological research. The enzyme transfers a farnesyl group to proteins, allowing these proteins to anchor to cellular membranes and carrying out their function within signal cascades. Inhibitors of the farnesyltransferase showed great success in animal models but the treatment of human malignant tumors has so far been of little success. In order to achieve an optimization, further knowledge about regulation and function of the farnesyltransferase is essential. The enzyme consist of an α-and a ß-subunit. Bachmann et al. were able to demonstrate that there are at least four orther variants of the ß-subunit in addition to the already known variant F1. Currently, nothing is known about the regulation of these variants. Therefore, the aim of this study was to characterize the promoter region of one of these variants (FNTB-F2). A DNA region of 2000 bp upstream of the translation initiation site was identified as promoter region of the FNTB-F2 variant. This region exhibits significant basal promoter activity in HEK-293 cells. A sequence of 300 bp upstream of the translation initiation site comprises the main activity. The core promoter region is localized 500 bp upstream the translation initiation site. This region is essential for basal promoter activity. This region contains six typical promoter elements and the main transcription start site is localized at the beginning of this region (between -519 and -488 bp). The transcription factor HNF1α was identified as a regulative factor of the FNTB-F2 variant. In silico analyses predicted twelve putative binding sites in the investigated FNTB-F2 promoter region. EMSA experiments verified three of this binding sites (-402/-426, -972/-996, -979/-1003). By stimulation with HNF1α the promoter activity could be increased seven times. The FNTB-F2 promoter was identified and the influence of the specific transcription factor HNF1α on the promoter activity was evaluated. These findings could be used for further clinical research. Especially, because of the demonstrated relevant dependency of the FNTB-F2 promoter activity from the transcription factor HNF1α, future studies may demonstrate a relevant meaning of the FNTB-F2 variant for other diseases. This was already demonstrated in this study for MODY diabetes Type 3.

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Stelmach, Patrick: Charakterisierung der putativen Promotorregion einer Variante der ß-Untereinheit der humanen Farnesyltransferase. 2017.

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