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Characterization of micro liquid chromatography - theoretical performance limits and practical aspects for routine analysis on the example of cytotoxic drugs

Hetzel, Terence

Miniaturized liquid chromatography (LC) is ideally suited to reduce the resource consumption without compromising data quality in the analytical laboratory. However, the applicability and handling of miniaturized LC in routine analysis is often being questioned. In addition, only little information on the theoretical performance limits of this separation technique is available. Therefore, the aim of this study was the characterization of micro-liquid chromatography (micro-LC) from the theoretical and practical point of view. For the evaluation the development of a fast method for the analysis of antineoplastic drugs from wipe samples using micro-LC-MS/MS was applied. The investigated analytes comprise polar as well as non-polar compounds. In addition, three critical peak pairs were included that either cannot be differentiated by mass spectrometry or are affected by ion suppression at co-elution. Therefore, a chromatographic separation was mandatory. Micro-LC was used as separation dimension using a column with an inner diameter of 300 µm due to the advantages of reduced resource consumption and high linear velocity leading to increased sample throughput. To achieve a chromatographic separation, a suitable chromatographic phase system was identified by principal component analysis (PCA). Afterwards, the column efficiency was investigated using van Deemter and kinetic plot analysis for isocratic and gradient elution. The results indicate a higher packing quality of the sub-2 µm fully porous particle packed column compared to larger particle diameters of various morphology. In addition, similar values for the reduced plate height were found in micro-LC compared to conventional column inner diameters (≥ 2.1 mm). The investigation of peak capacity also demonstrates the benefit of sub-2 µm fully porous particles for gradient times between 5 s and 5 min. Further optimization of the extraction efficiency, ion source parameters and system design was done to establish the method on basis of micro-LC-MS/MS. This hyphenation technique enables to separate the target analytes within 2.5 min at a flow rate of only 25 µL min-1. Thereby the sample throughput can be increased by a factor of 2 reducing the resource consumption by 98% compared to the previously used conventional LC-MS/MS method. Method validation was accomplished to demonstrate that sensitivity and robustness of the developed method is given in a routine environment. Furthermore, it was shown that the method can be used to analyze real samples from hospital pharmacies in order to verify the reference value of 0.1 ng cm-2 for workplace contamination of antineoplastic drugs. In summary, it was exemplarily demonstrated that micro-LC can successfully replace conventional LC-MS in targeted ultrasensitive MS analysis.

Verfahren wie die miniaturisierte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC) sind ideal geeignet, um den Verbrauch an Ressourcen zu verringern ohne dabei die Datenqualität im analytischen Labor negativ zu beeinflussen. Nichtsdestotrotz wird die Anwendbarkeit dieser Technik in der Routineanalytik aufgrund der Handhabbarkeit oftmals kritisch hinterfragt. Des Weiteren sind nur wenige Informationen bezüglich der theoretischen Leistungsfähigkeit dieser Trenndimension verfügbar. Aus diesem Grund ist das Ziel dieser Arbeit die Charakterisierung der Mikro-Flüssigkeitschromatographie (Mikro-LC) aus Sicht der Theorie und Praxis. Zur Bewertung wurde die Entwicklung einer schnellen Analysenmethode ausgewählter Zytostatika von Wischproben mittels Mikro-LC-MS/MS verwendet. Die untersuchten Analyten umfassen dabei sowohl polare als auch unpolare Substanzen. Weiterhin sind drei kritische Peakpaare enthalten, bei denen entweder eine Ionensuppression bei Koelution beobachtet wird oder eine Unterscheidung mittels Massenspektrometrie nicht möglich ist. Aus den genannten Gründen ist eine chromatographische Trennung notwendig. Um dies zu erreichen, wurden Mikro-LC-Säulen mit einem Innendurchmesser von 300 µm eingesetzt. Dies bietet neben dem reduzierten Verbrauch von Ressourcen den Vorteil, dass durch hohe lineare Fließgeschwindigkeiten ein erhöhter Probendurchsatz generiert werden kann. Um eine chromatographische Trennung zu erreichen, wurde ein geeignetes Phasensystem durch den Einsatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) identifiziert. Anschließend wurde die Effizienz miniaturisierter Trennsäulen mittels van Deemter und Kinetic Plot Analyse sowohl für die isokratische Arbeitsweise als auch für die Gradientenelution untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass vollporöse Partikel mit einem Partikeldurchmesser von kleiner 2 µm (sub-2 µm) eine verbesserte Packungsqualität gegenüber größeren Partikeln unterschiedlicher Morphologie aufweisen. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass im Vergleich zu konventionellen Innendurchmessern vergleichbare Packungsqualitäten erreicht werden können. Die Untersuchung der Peakkapazität für Gradientenlaufzeiten zwischen 5 s und 5 min ergab, dass mit vollporösen sub-2 µm Partikeln eine höhere Peakkapazität pro Zeiteinheit generiert werden konnte. Des Weiteren wurden neben dem Systemaufbau, die Extraktionseffizienz sowie die Ionenquellenparameter optimiert, um die Methode auf Basis der Mikro-LC-MS/MS zu etablieren. Durch diese Kopplung konnten die Komponenten innerhalb von 2.5 min bei einer Flussrate von lediglich 25 µL min-1 getrennt werden. Dadurch konnte der Probendurchsatz um den Faktor 2 bei gleichzeitiger Reduzierung der Ressourcen um 98% im Vergleich zur zuvor etablierten konventionellen LC-MS/MS gesteigert werden. Anschließend wurden Validierungsdaten erhoben, um die Sensitivität und Robustheit der entwickelten Methode im Routineumfeld zu demonstrieren. Anhand von Realproben aus Krankenhausapotheken wurde gezeigt, dass der Referenzwert für die Arbeitsplatzkontamination von Zytostatika von 0,1 ng cm-2 mittels der Methode überprüft werden kann. Damit konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Mikro-LC qualifiziert ist, die konventionelle LC-MS im Bereich der ultra-sensitiven Targetanalytik zu ersetzen.

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Hetzel, Terence: Characterization of micro liquid chromatography - theoretical performance limits and practical aspects for routine analysis on the example of cytotoxic drugs. 2017.

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