Role of orbital fibroblasts in tissue remodeling of Graves' orbitopathy - involvement of hypoxia dependent and independent pathways

Görtz, Gina-Eva

Graves’ disease (GD) is an autoimmune disease caused by autoantibodies directed mainly against the thyrotropin stimulating hormone receptor (TSHR) leading to hyperthyroidism. Graves’ orbitopathy (GO) is the common extra-thyroidal manifestation of Graves’ disease is characterized by inflammation and expansion of the retroocular connective/fat tissue and of the extraocular muscles (EOM). The expansion of the orbital tissue within the limited space of the bony orbit leads to proptosis, extraocular muscle dysfunction, and, in severe cases, to an optic nerve compression. Inflammation and enlargement of the orbital tissue can cause hypoxia and consequently induce hypoxia-inducible-factor 1 (HIF-1) pathways. The work presented in this thesis addressed the role of orbital fibroblast (OF) and/or mesenchymal stem cells (MSC) for pathogenesis of GO in patients and mouse model. We aimed to characterize human and mouse OF and/or MSC and involvement of hypoxia depending and independent pathways in the pathophysiological process leading to GO. The central cell type in this pathophysiologic process are the orbital fibroblasts (OF) which we derived either from fat biopsies of GO patients/control persons or from orbital tissue of GO/control mouse model. Additionally, we identified MSC in the fat tissue of GO patients and showed that OF shared all biological characteristics of MSC: Both the OF and the MSC expressed a typical MSC surface marker set, suppressed T cell proliferation and secreted cytokines. Furthermore, the cells produced hyaluronan and were able to differentiate along adipogenic, osteogenic, chondrogenic, myogenic, and neuronal pathways. It appears that OF population comprises undifferentiated progenitor cells responsible for adipogensis and/or myogenesis in GO. To analyze whether hypoxia dependent pathways are involved in tissue remodeling of GO we investigated the role of HIF-1 action for angiogenesis and adipogensis. Most likely as a consequence of hypoxia we found increased vascularization and HIF-1α positive cells in the connective/fat tissue of GO patients. OF derived thereof expressed higher HIF-1α levels and secreted elevated levels of VEGF in an HIF-1 dependent manner. Furthermore, hypoxia induced HIF-1 dependent adipogenic differentiation of OF which could be further increased by stimulation of TSHR using TSH indicating an unfavorable marriage between hypoxia and effects of autoimmunity. Smoking is the strongest risk factor for GO and develops it full effect most likely through smoke ingredients and hypoxia. Interestingly, we found that OF derived from GO smoker more strongly induced HIF-1α levels in response to cigarette smoke extract and hypoxia compared to GO non-smoker. Increased HIF-1α expression can contribute to the strong tissue expansion observed GO smoker. To investigate pathological changes in OF during the course of GO we established a preclinical mouse model of GO induced by genetic immunization of human TSHR A- subunit plasmid. The pathological features of GO in the experimental mouse model were similar in orbital pathology to those present in patients with GO; GO mice developed TSHR antibodies with different levels of stimulating and blocking activity as well as TSHR antigen specific response of splenic T cells. Furthermore GO mice just like GO patients developed thyroid dysfunction and orbital disease with mice showing either more enlargement of orbital adipose tissue or myopathy of EOM. We derived OF from tissue comprise of EOM and adipose of the immunized mice. Mouse OF (mOF) expressed MSC marker, elevated levels of TSHR and insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) similar to OF derived from GO patients. Likewise, mOF showed increased adipogenesis and enhanced hyaluronan secretion by activation of TSHR and IGF-1R. Moreover, in response to hypoxia OF derived from GO mice enhanced HIF-1α levels, suggesting that hypoxia dependent signaling is involved in orbital pathogenesis. Thus, OF derived from GO mice display a pathogenic cell type similar to OF derived from GO patients. In conclusion, OF and MSC are central for GO pathogenesis in patients and mouse model. HIF-1 dependent pathways are involved in tissue remodeling and expansion during pathogenesis of GO. The understanding of the contribution of different orbital cell populations for tissue remodeling in response to hypoxia during the course of the eye disease will be further studied in the GO mouse model. In addition the role of hypoxia for inflammation in context of autoimmunity remains to be discovered. This will lead to a better insight of disease pathogenesis and is fundamental to develop potential novel therapeutic targets.

Morbus Basedow (Graves‘ Disease) ist eine Schilddrüsenerkrankung, die durch Autoantikörper verursacht wird, die hauptsächlich gegen den Thyreotropin-stimulierenden Hormonrezeptor (TSHR) gerichtet sind und eine Hyperthyreose zur Folge haben. Endokrine Orbitopathie (Graves' Orbitopathie, GO) ist eine extrathyroidale Manifestation, die üblicherweise im Zusammenhang mit Morbus Basedow auftritt und durch Entzündung und Ausdehnung des retrookularen Bindegewebes und der extraokulären Muskeln (EOM) gekennzeichnet ist. Die Ausdehnung des orbitalen Gewebes in die räumlich begrenzte, knöcherne Orbita führt zu Proptosis, Muskeldysfunktion und in schweren Fällen zu einer Kompression des Sehnervs. Die Entzündung und Ausdehnung des orbitalen Gewebes kann eine Sauerstoffunterversorgung (Hypoxie) des Gewebes verursachen und somit zu einer Induktion von Hypoxie-induzierbarer Faktor 1 (HIF-1) abhängigen Signalwege führen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle orbitaler Fibroblasten (OF) und/oder mesenchymaler Stammzellen (MSC) in der Pathogenese von GO Patienten und im GO Mausmodell. Ziel war die Charakterisierung humaner und muriner OF und/oder MSC im Hinblick auf Hypoxie-abhängige und unabhängige pathophysiologische Prozesse der GO. Orbitale Fibroblasten sind der zentrale Zelltyp im pathophysiologischen Prozess, und wurden entweder aus Fettbiopsien von GO Patienten/Kontrollpersonen oder aus orbitalem Gewebe eines GO Mausmodells/Kontrollmäuse gewonnen. Darüber hinaus identifizierten wir MSC im orbitalen Fettgewebe von GO Patienten und zeigten, dass OF alle biologischen Merkmale der MSC teilten: Sowohl OF als auch MSC exprimierten typische MSC Oberflächen-Marker, unterdrückten die T-Zellproliferation und sezernierten Zytokine. Des Weiteren produzierten sie Hyaluronsäure und waren in der Lage sowohl adipogen, osteogen und chondrogen als auch myogen und neuronal zu differenzieren. Dies zeigte, dass die OF Population undifferenzierte Vorläuferzellen beinhaltet, die für die gesteigerte Adipogenese und/oder Myogenese im Gewebe von GO Patienten verantwortlich sein könnten. Um zu untersuchen, ob Hypoxie-abhängige Signalwege in den Gewebeumbau bei GO involviert sind, analysierten wir die Rolle von HIF-1 für die Angiogenese und Adipogenese unter hypoxischen Bedingungen. Als eine mögliche Folge der Hypoxiewirkung fanden wir eine erhöhte Vaskularisierung und HIF-1α-positive Zellen im Binde-/Fettgewebe von GO Patienten. Die aus dem Fettgewebe der Patienten gezüchteten OF zeigten eine höhere HIF-1 Expression und sezernierten HIF-1 abhängig mehr VEGF. Des Weiteren wurde unter Hypoxie die adipogene Differenzierung der OF HIF-1 abhängig induziert. Die durch Hypoxie induzierte Adipogenese konnte durch Stimulation des TSHR unter Verwendung von TSH noch weiter gesteigert werden, was das ungünstige Zusammenwirken von Hypoxie und Effekten der Autoimmunität widerspiegelt. Rauchen ist der stärkste Risikofaktor für den Schweregrad einer GO und entfaltet seine Wirkung wahrscheinlich durch die Kombination von Rauchbestandteilen und Hypoxie. Interessanterweise konnten wir feststellen, dass OF von GO Rauchern im Vergleich zu GO Nichtrauchern höhere HIF-1α Mengen in Reaktion auf Zigarettenrauchextrakt und Hypoxie aufwiesen. Die erhöhte HIF-1α Expression bei GO Rauchern könnte die starke Gewebsexpansion, welche bei GO Rauchern beobachtet wird, begünstigen. Um die pathologischen Veränderungen der OF im Verlauf einer GO untersuchen zu können, etablierten wir ein präklinisches GO Mausmodell, das durch genetische Immunisierung mit einem Plasmid, welches für die humane TSHR A-Untereinheit kodierte, induziert werden konnte. Die TSHR immunisierten Mäuse entwickelten alle Anzeichen von Morbus Basedow mit GO: Die Mäuse entwickelten TSHR-Antikörper mit unterschiedlichen Mengen an stimulierenden- und/oder blockierenden Antikörpern, eine TSHR-Antigen-spezifische Antwort von T-Zellen der Milz, Schilddrüsenfunktionsstörungen und Orbitopathie. Dabei entwickelten die Mäuse ähnlich wie GO Patienten im unterschiedlichen Maße eine Vergrößerung des orbitalen Fettgewebes und/oder eine Myopathie der EOM. Aus dem orbitalen Gewebe der Mäuse, welches überwiegend aus EOM und Fett bestand, isolierten und charakterisierten wir Fibroblasten. Ähnlich wie die OF von Patienten, exprimierten die Maus OF (mOF) typische MSC Marker, TSHR und Insulin Wachstumsfaktor-1-Rezeptor (IGF-1R). Ebenso zeigten mOF eine gesteigerte Adipogenese und vermehrte Hyaluronsäure Sekretion in Antwort auf TSHR und IGF-1R Aktivierung. Darüber hinaus, zeigten OF von GO Mäusen erhöhte HIF-1α Mengen unter hypoxischen Bedingungen, was darauf hindeutete, dass Hypoxie-abhängige Signalwege an der Pathogenese einer GO bei Mäusen beteiligt sein könnten. Somit zeigten die OF von GO Mäusen einen pathogenen Zelltyp, der den OF von GO Patienten ähnlich ist. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass OF und/oder MSC eine zentrale Zellpopulation in der Pathogenese von GO Patienten und GO Mausmodell darstellen. HIF-1 abhängige Signalwege sind am Gewebeumbau und -expansion beteiligt. Das Verständnis, wie verschiedene orbitale Zellpopulationen am Gewebeumbau als Reaktion auf Hypoxie mitwirken, wird während des Verlaufs der Augenerkrankung im GO Mausmodell noch weiter untersucht. Darüber hinaus ist es von Interesse die Rolle von Hypoxie-abhängigen Signalwege im Entzündungsprozess im Kontext der Autoimmunität aufzuklären. Dies kann zu einem besseren Einblick in die Pathogenese der GO führen und ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.

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Görtz, Gina-Eva: Role of orbital fibroblasts in tissue remodeling of Graves' orbitopathy - involvement of hypoxia dependent and independent pathways. 2017.

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