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Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung zur präparativen Aufreinigung funktionalisierter anorganischer Nanopartikel

Büscher, Sascha

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Messungen mit verschiedenen Sorten von Nanopartikeln unter wechselnden Bedingungen mittels Asymmetrischer Fluss Feld-Fluss Fraktionierung durchgeführt. Ziel war es, diese Methode als sanfte Alternative zur herkömmlichen Aufreinigung mittels Ultrazentrifugation und Redispergierung durch die Sonotrode zu etablieren. Die dargestellten Ergebnisse sprechen jedoch nicht hinreichend für eine uneingeschränkte Anwendung dieser Methode. Generell wurde durch die Messungen belegt, dass das Ergebnis in erheblichem Maße von den einzustellenden Parametern, wie dem Injektionsfluss, der Injektions- bzw. Fokussierungszeit, dem Fokussierungsfluss und dem Querfluss abhängt. Dies wird auch schon durch die Gleichungen 3.5 bzw. 3.7 zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten beschrieben. Weitere Faktoren, die einen starken Einfluss auf das Ergebnis haben sind der zeitliche Verlauf des Querflusses während der Trennungsphase, die Art der Partikel bzw. deren Stabilisierung sowie die Art der Membran. Alle diese Faktoren können mehr oder weniger direkt beeinflusst werden und müssen bei der Bewertung des Ergebnisses berücksichtigt werden. So konnten beispielsweise für CaP/PEI-Nanopartikel mit der RC- und PES-Membran gute Ergebnisse mit einer Rückgewinnungsrate von bis zu 92 % erzielt werden, wie die Messungen 14, 37 und 38 belegen. Auch den positiven Einfluss durch Reduktion der Wechselwirkungen zwischen Partikel und Membran konnte mit den Messungen 39 bis 43 bestätigt werden. Außerdem wurde nachgewiesen, dass ungebundenes Polyethylenimin mittels AF4 von den Partikeln abgetrennt werden kann, wie die Messungen 47 und 48 belegen. Für die CaP/CMC-Nanopartikel konnte jedoch trotz hoher Rückgewinnungsrate keine hinreichende Trennung erzielt werden, wie die Messungen 49 bis 53 zeigen. Insgesamt hat sich gezeigt, dass sich die RC-Membran offenbar besser für geringe Injektionsvolumina (bis 2 mL) an CaP/PEI-Nanopartikeln eignet, während mit der PES-Membran bessere Ergebnisse mit größeren Mengen (> 5 mL) erzielt wurden. Generell zeigt sich jedoch, dass auch bei idealen Durchflussparametern ein nicht unerheblicher Teil der injizierten Partikel an der Membran adsorbiert, da die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und der Membran auch mit einem Zusatz an NaCl nicht vollständig unterbunden werden konnten. Dies ist der Hauptgrund, weshalb die AF4 unter den gegebenen Bedingungen nur bedingt geeignet für die präparative Aufreinigung dieser Partikel erscheint. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Änderung der Morphologie, die in einigen Messungen beobachtet wurde. Da dies insbesondere bei Messungen mit hohem Querfluss beobachtet wurde, sollte bei zukünftigen Anwendungen hinsichtlich des Querflusses sehr genau zwischen Nutzen und Risiko abgewogen werden. Für die metallischen Partikel ergibt sich ein weiteres Problem. Diese zeigten unter den gewählten Bedingungen für alle Messungen einen viel stärkeren Trend zur Adsorption an der Membran, als es für die Calciumphosphat-Partikel der Fall war. Dies deutet daraufhin, dass nicht nur die Oberflächenfunktionalisierung, sondern auch der Partikelkern einen Einfluss auf die Wechselwirkung mit der Membran ausübt. Eine weitere Anwendung sollte daher nur in Betracht gezogen werden, wenn die Wechselwirkung zwischen Partikeln und Membran zu einem hohen Anteil unterbunden werden können. Sind biologische Anwendungen mit den gereinigten Partikeln geplant, so scheiden Tenside für diesen Zweck aus. Es ist jedoch eine Oberflächenfunktionalisierung der Membran selbst denkbar. Auf diese Weise könnte möglicherweise erreicht werden, dass die Partikel weniger stark an der Membran adsorbieren und gleichzeitig nicht durch weitere Zusätze kontaminiert werden. Auch für die Calciumphosphat-Nanopartikel sollte diese Methode in Betracht gezogen werden, um zunächst die Reproduzierbarkeit zu steigern, bevor eine Anwendung an biologisch aktiven Partikeln untersucht wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel dargestellt, die über eine kovalente Funktionalisierung den Komplexliganden DOTA tragen. Dieser ermöglicht die Beladung mit Kupfer(II)-Ionen. Die gezeigten Analysen bestätigen, dass sich diese Partikel hinsichtlich Größe und Morphologie kaum von den anderen dargestellten Calciumphosphat-Nanopartikeln unterscheiden. Auch konnten sie mit in einer recht einfachen Methode hergestellt werden. Die Beladungseffizienz mit Kupfer(II)-Ionen liegt dabei in dem literaturbekannten Bereich. Um eine höhere Beladung der Partikel mit Kupfer zu erreichen, wäre es sinnvoll, einen anderen Liganden zu wählen, der von sich aus bereits eine erhöhte Aufnahmefähigkeit für Kupfer besitzt.

Within the first part of this thesis, multiple measurements with different kinds of nanoparticles were carried out using various settings concerning asymmetric flow field-flow fractionation. The main goal was to establish this method as soft alternative to the common way of purification, which is ultracentrifugation followed by sonication. However, the results presented do not sufficiently indicate the full application of this method. In general, the measurements showed that the results depend to a extensive level on the flow parameters, which are the injection flow, the injection or focusing time, the focus flow and the cross flow. This is also already described by the equations 3.5 and 3.7 for the calculation of the diffusion coefficient. Other factors which have a strong influence on the result are the temporal course of the cross flow during the elution step, the type of the particles or their stabilization as well as the type of the membrane. All these factors can be more or less directly influenced and must be taken into account when evaluating the results. For example, good results with a recovery rate of up to 92 % could be achieved for CaP/PEI nanoparticles with the RC and PES membranes, as shown by measurements 14, 37 and 38. Also the positive influence by reducing the interactions between particles and membrane could be confirmed with the measurements 39 to 43. Moreover, it was shown that unbound polyethylenimine can be separated from the particles by means of AF4, as shown by measurements 47 and 48. For the CaP/CMC nanoparticles, however, a satisfactory separation was not achieved despite a high recovery rate, as shown in the measurements 49 to 53. Overall, the RC membrane has been shown to be better suited for small injection volumes (up to 2 mL) of CaP/PEI nanoparticles, whereas better results with larger amounts (> 5 mL) were achieved with the PES membrane. In general, it is found that even in the case of ideal flow parameters, a not inconsiderable part of the injected particles adsorbs to the membrane, since the interactions between the particles and the membrane could not be completely prevented even with the addition of NaCl. This is the main reason why the AF4 appears to be only of limited applicability for the preparative purification of these particles under the given conditions. Another important aspect is the change in the morphology observed in some measurements. Since this was observed in particular in the case of measurements with a high cross flow, future applications should be weighed very precisely between the risk and the benefit regarding the cross flow. A further problem arises for the metallic particles. Under the selected conditions these showed a much stronger trend for adsorption to the membrane for all measurements as it has been the case for the calcium phosphate particles. This suggests that not only the surface functionalization but also the particle core exerts an influence on the interaction with the membrane. A further application should therefore only be considered if the interaction between particles and membrane can be prevented to a large extent. If biological applications are planned with the purified particles, surfactants are excluded for this purpose. However, a surface functionalization of the membrane itself is conceivable. In this way, it could possibly be achieved that the particles adsorb less strongly to the membrane and are not contaminated at the same time by further additives. This method should also be considered for the calcium phosphate nanoparticles in order to first increase the reproducibility before an application to biologically active particles is investigated. In the second part of this thesis, calcium phosphate nanoparticles were prepared which carry the complex ligand DOTA through a covalent functionalization. This allows loading with copper (II) ions. The performed analyses prove that these particles differ little in terms of size and morphology from the other calcium phosphate nanoparticles shown in this work. Also, they can be prepared by means of a rather easy method. The loading efficiency with copper (II) ions is in the range known from the literature. In order to achieve a higher loading of the particles with copper, it would be advisable to choose another ligand which already has an increased absorption capacity for copper.

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Büscher, Sascha: Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung zur präparativen Aufreinigung funktionalisierter anorganischer Nanopartikel. 2017.

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