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The contribution of DNA DSB repair pathways to the repair of chromosome breaks throughout the cell cycle

Murmann-Konda, Tamara Theresa Yasmin

Ionizing radiation (IR) induced DNA double strand breaks (DSBs) pose a major threat to cellular homeostasis, as unrepaired or misrepaired DSBs can lead to chromosomal aberrations that threaten genomic stability and cell survival. Higher eukaryotes have evolved highly sophisticated DSB repair pathways to mitigate the consequences associated with DSBs. Higher eukaryotes repair DSBs predominantly by classical DNA-PK dependent non homologous end joining (c-NHEJ), or by homologous recombination repair (HRR). While c-NHEJ can be engaged in all cell cycle phases, HRR is restricted to the later S- and G2- phase of the cell cycle due to its requirement for a sister chromatid. Recently, an alternative (alt-EJ), error prone DSB repair pathway operating as a backup for failures in c-NHEJ and HRR was shown to function throughout the whole cell cycle with peak activity in the G2-phase of the cell cycle. Previous experiments in our laboratory suggest a dose dependent choice for the engagement of repair pathways in the repair of IR induced DSBs. We here investigated the contribution of HRR, c-NHEJ and alt-EJ to the repair of IR induced chromatid breaks, as measured by premature chromosome condensation, by exposing different wildtype, HRR mutant or c-NHEJ mutant cell lines to a broad spectrum of IR doses. Particular focus is placed on the G2-phase of the cell cycle, where all three DSB repair pathways can engage. Our results suggest a dose dependent repair pathway switch from slow HRR to fast c-NHEJ. Data obtained show that HRR is mainly engaged in the processing of CBs after exposure of low doses (<2 Gy). C-NHEJ on the other hand gains ground in the repair of IR induced chromatid breaks in a dose dependent manner. Moreover, we investigated the formation of chromosomal exchanges. We found a clear contribution of c-NHEJ and alt-EJ to CE formation at high IR doses (5 Gy), while the contribution of DSB repair pathways to CE formation after low doses of IR still need to be clarified. Finally yet importantly, we developed a protocol for the premature chromosome condensation technique using EdU staining to discriminate between S-phase and G2-phase PCCs. This technique allows for the first time cell cycle dependent analysis of IR induced cytogenetic damage and paves the way to further mechanistic investigation.

Strahleninduzierte Doppelstrangbrüche stellen eine große Gefahr für die Zell- Homöostase dar. Denn nicht reparierte oder falsch reparierte Doppelstrangbrüche können zu genomischer Instabilität und zur Bildung von Chromosomenaberrationen beitragen. Früh in der Evolution haben höhere Eukaryonten Mechanismen entwickelt, um den Konsequenzen, die mit Doppelstrangbrüchen assoziiert sind, entgegen zu wirken. Grundsätzlich reparieren höhere Eukaryonten Doppelstrangbrüche entweder mit klassischer nicht- homologer Endverknüpfung (classical non homologous end joining, c-NHEJ) oder mit Homologer Rekombination (HR). Während c-NHEJ in allen Phasen des Zellzyklus aktiviert werden kann, ist HRR auf die späte S-Phase und G2-Phase beschränkt, da HRR eines Schwesterchromatids als Vorlage bedarf. Vor kurzem wurde eine weitere Form der Reparatur, die sogenannte alternative Endverknüpfung (alternative end joining, alt-EJ) entdeckt die unter anderem durch eine hohe Fehler Rate in der Reparatur charakterisiert ist. Studien haben gezeigt, dass die alternative Endverknüpfung in allen Phasen des Zellzyklus aktiviert werden kann, jedoch eine höhere Aktivität in der G2-Phase aufweist. Des Weiteren wurde gezeigt, dass alt-EJ als ein back-up Mechanismus funktioniert, der ins Spiel kommt, wenn c-NHEJ oder HRR an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen scheitern. Vorhergegangene Experimente, in unserem Labor deuten auf eine Dosis abhängige Regulation der Doppelstrangbruch- Reparaturmechanismen hin. In der hier vorliegenden Arbeit haben wir die Beteiligung von HRR, c-NHEJ und alt-EJ an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen auf der Basis von Strahleninduzierten Chromatidbrüchen, die durch Vorzeitige Chromosomen Kondensation (premature chromosome condensation, PCC) sichtbar gemacht wurden, gemessen. Einen besonderen Fokus haben wir auf die G2-Phase des Zellzyklus gelegt, da alle drei Reparaturmechanismen in dieser Phase aktiviert werden können. Darüber hinaus haben wir verschiedene Chinesische Hamsterzelllinien mit verschiedenem genetischem Hintergrund in unsere Experimente integriert, um unterschiedliche Aspekte der Reparaturmechanismen zu beleuchten. Unsere Daten weisen auf, dass HRR überwiegend Chromatidbrüche nach niedriger Strahlendosis (<2 Gy) verarbeitet, während c-NHEJ mit höher werdender Strahlendosis (>2Gy) immer wichtiger für die Doppelstrangbruch Reparatur wird. Eine Beteiligung von alt-EJ an der Verarbeitung von Chromatidbrüchen konnten wir nicht nachweisen. Neben Chromatidbrüchen haben wir auch die Bildung von Chromatidaberrationen untersucht. Eine besondere Rolle in der Unterdrückung von Chromatidaberrationen kommt der Homologen Rekombination zu. Darüber hinaus haben wir eine klare Beteiligung von c-NHEJ nach Bestrahlung mit hohen Dosen (5 Gy) festgestellt. Auch alt-EJ ist an der Bildung von Chromatidaberrationen vor allem in Zellen, die Defekte in c-NHEJ aufweisen und mit einer hohen Strahlendosis (5 Gy) bestrahlt wurden, beteiligt. Des Weiteren haben wir ein Protokoll auf der Basis von EdU Färbetechniken entwickelt, um die PCC Technik zu validieren. Diese Methode erlaubt es uns zwischen PCCs zu unterscheiden die während der Bestrahlung in der S-Phase oder in der G2-Phase waren. Mit dieser Methode haben wir Zellzyklusspezifität für die PCC Technik erreicht und konnten so unsere Daten validieren.

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Murmann-Konda, Tamara Theresa Yasmin: The contribution of DNA DSB repair pathways to the repair of chromosome breaks throughout the cell cycle. 2017.

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