Simulationen supramolekularer Systeme

Ehlers, Martin

1. Zusammenfassungen der Projekte Die Zusammenfassung der einzelnen Projekte dieser Arbeit wird, wie auch bei der Darstellung der Ziele, in drei Unterkapiteln erfolgen. 1.1. SARS CoV Mpro – Design eines potentiellen Dimerisierungsinhibitoren Ziel dieses Projektes war es, einen Weg zur Hemmung der SARS CoV Mpro aufzuzeigen, welcher über die Unterdrückung der für die Enzymaktivität essentiellen Dimerisierung der Protease wirkt. Die Analyse der Dimerisierungsfläche erfolgte optisch und mithilfe des Programms AutoLigand, wodurch ein klar abgegrenztes Volumen für das Ligandendesign definiert werden konnte. Für die rationale Entwicklung möglicher Liganden wurden Oberflächenmerkmale innerhalb der Dimerisierungsfläche identifiziert, welche durch einen geeigneten Binder adressiert werden können. Als zentraler Angriffspunkt eines potentiellen Dimerisierungsinhibitors wurde Arg 4 der Mpro herausgestellt, da es durch seine exponierte Position sowie die es umgebene Topographie, leicht zu erreichen scheint. Außerdem stellt Arg 4 eine für die Dimerisierung benötigte Aminosäure dar. Arginin kann an sich gut durch Guanidin-Rezeptoren adressiert werden, im Falle des Arg 4 liegt die Seitengruppe zudem exponiert, wodurch im Umfeld ausreichend Raum für eine Rezeptoreinheit besteht. Als Guanidin-Rezeptor wurde die von Schrader entwickelte Bisphosphonat-Pinzette (BP) ausgewählt, da sie relativ klein ist und sich ihre Ladung durch Methylveresterung der Phosphonat-Gruppen in einem Bereich von 0 bis 4 einstellen lässt. Neben der BP wurden weitere Fragmente gesucht, welche eine dem Arg 4 benachbarte aromatische Tasche besetzen können. Angestrebt wurde außerdem eine Art Oberflächenmimikry, welche die das Arg 4 umgebende unpolare, muldenförmige Topographie nachahmt, um so die Bindung und Lage des zu designenden Liganden stabilisieren zu können. Hierzu wurden in einem ersten kombinatorischen Schritt die aromatischen Aminosäuren His, Phe und Trp über Gly oder N-Ala als Linker an die unterschiedlich geladene BP angebracht und an der definierten Bindungsstelle durch Docking und Clusteranalyse untersucht. Hierbei stellte sich die Kombination BP(OMe)-Gly-Phe als günstig heraus, da sie den konzeptionellen Vorgaben des entwickelten Designs sehr gut entsprach. Sie zeigte, dass die BP-Gruppe das Arg 4 komplexiert, wobei gleichzeitig der Phenylring des Phe in der aromatischen Tasche bindet und der C-Terminus dieses kleinen Semipeptids dem Lösungsmittel zugewandt war, wodurch eine Weiterentwicklung des Liganden ohne Veränderung der Pose realisiert wurde. (Vgl. Abbildung 15, S. 37) Diese wurde dann, ausgehend von der im ersten Schritt des Designs gefundenen Struktur, durch Variation des Linkers und der Erweiterung der Struktur um eine GuaCbz- beziehungsweise OBn-Einheit als Oberflächenmimikry derivatisiert und die sich ergebene Gruppe von Konzeptliganden erneut durch Dockingtechniken untersucht. Der Ligand BP Phe GuaCbz stellte sich als günstigster Kandidat heraus, da er weiterhin Arg 4 über die BP-Einheit komplexiert, Phe in der aromatischen Tasche bindet und sich die GuaCbz-Gruppe dicht an die benachbarte, muldenförmige Oberfläche anschmiegt. Die so von dem Konzeptliganden eingenommene Konformation stabilisiert sich über zwei intramolekulare Wasserstoffbrücken und erreicht zudem in der virtuellen Studie sehr gute Dockingscores. Zur Einschätzung des gewünschten Einflusses auf die Dimerisierung der Mpro wurde der Dockingscore am Monomer der Protease (-9.13 kcal/mol, entspricht ΔGBind) rechnerisch mit ihrer Dimerisierungskonstante (100 μM, ergibt ein ΔGBind von 5.37 kcal/mol) verglichen. Aus diesem mathematischen Vergleich ergibt sich, dass der designte Ligand besser an der monomeren Mpro bindet als die Protease an sich selbst. Es kann davon ausgegangen werden, dass es möglich sein sollte, die Dimerisierung durch den Liganden BP-Phe-GuaCbz zu unterdrücken. (Vgl. Abbildung 48) Die in diesem Projekt angewandte Technik des de novo Designs eines neuen Liganden für eine ebenfalls neue Bindungsstelle ist vielseitig anwendbar. Die enzymatische Aktivität einer essentiellen Protease eines pathogenen Erregers mechanistisch, über die Hinderung der Aggregation des Enzyms, zu inhibieren, ist ein elegantes und erfolgsversprechendes Beispiel dieser Technik. 1.2. β-Tryptase – Evolution eines Bindungsmodells Die Weiterentwicklung eines bestehenden Bindungsmodells für Inhibitoren der β-Tryptase zur Adaption neuer experimenteller Befunde war das Ziel des zweiten Projekts dieser Arbeit. Das bisherige Modell zeigte eine Möglichkeit des Hemmmechanismus für vierarmige Liganden, welche durch Bindung an Aminosäuren am Eingang der zentralen Pore der Protease diese verschlossen. Hierdurch wurde das Eintreten eines potentiellen Substrates verhindert, wodurch es nicht zu den aktiven Zentren des Enzyms vordringen konnte und somit dessen Katalyse inhibiert wurde. Dieses Modell konnte jedoch nicht die unterschiedliche Hemmung der β-Tryptase durch zwei sequenzisomere, dreiarmige Substanzen (82, Ki = 22,5 nM und 96, Ki =114 nM, siehe Abbildung 20, S. 47) erklären, da diese ebenfalls auf analoge Weise die zentrale Pore versperren könnten. Die Analyse der vorliegenden Daten zeigte auf, dass diese dreiarmigen Inhibitoren nicht-kompetitiv wirkten. Eine von Heider durchgeführte virtuelle Untersuchung des Inneren der Pore deckte weitere Bindungsstellen im Umfeld der aktiven Zentren und nahe der Oligomerisierungsflächen der tetrameren Protease auf. Diese Informationen sollten zusammen mit den Erkenntnissen über die Hemmwirkung der beiden Isomere in das neue Modell einfließen. (Siehe Abbildung 49) Da die beiden Strukturen 82 und 96 relativ groß und sehr flexibel waren, mussten sie vor der Anwendung der Software Glide in kleinere Systeme zerlegt werden. Zu diesem Zweck wurden die Liganden von zwei ihrer drei Arme befreit. Die so entstandenen einarmigen Modellverbindungen wurden dann sukzessive an der inneren Porenoberfläche gedockt. Hierzu wurden drei Enclosing Boxes so positioniert, dass sie zum einen die Aminosäuren am Eingang der Pore und zum anderen die von Heider identifizierten neuen Bindungsstellen im Inneren der Pore abdeckten. Jede der drei Boxen deckte mehr als ein Drittel des zu untersuchenden Bereichs ab, womit auch die Grenzflächen zwischen den Boxen ausreichend berücksichtigt wurden. Während der Analyse möglicher Posen der Modellverbindungen musste der nicht-kompetitive Hemm- mechanismus berücksichtigt werden. Hierzu wurden die Berechnungen der Maps innerhalb der Boxen so gesteuert, dass die Liganden nicht direkt an den aktiven Zentren binden konnten. Das Docking der Modellverbindungen erfolgte, indem der Phenylring der Verbindungen mittig in der Pore gehalten wurde. Auf diese Weise konnte der Arm während der Docking-Läufe die innere Porenoberfläche abtasten. Durch den mittig positionierten Phenylring wurde die spätere Kombination der einzelnen Modellsysteme zu den vollständigen Liganden erleichtert. Die mithilfe dieser Methode generierten Posen wurden zunächst nach ihren Dockingscores sortiert, worauf die besten Posen der Modellverbindungen eines Liganden auf ihre Kombinierbarkeit optisch geprüft wurden. Nach der Identifizierung günstiger und kombinierbarer Posen wurden diese unter Zuhilfenahme der Sculpting-Technik an ihren Phenylringen zur Deckung gebracht und zu den vollständigen Inhibitoren kombiniert. Durch diesen manuellen Eingriff ist es notwendig im Anschluss an diese Kombination der Modellverbindungen die entstandene Pose einer Konformationsanalyse zu unterwerfen, um die Stabilität der Pose und damit ihre Relevanz zu überprüfen. Auf diese Weise entstanden Posen von 82 und 96, welche anhand ihres gemittelten Dockingscores und des über die Konformationssuche eingeschätzten Unterschieds in ihrer Bindungsenergie verglichen wurden. Hierbei zeigten die Rechnungen für den Liganden 82 im Vergleich zu 96 einen um 1 kcal/mol besseren Score auf, jedoch eine um ca. 12 kcal/mol ungünstigere Bindungsenergie. Der rein energetische Vergleich der beiden Posen konnte demnach nicht als Rechtfertigung für die um einen Faktor von 5 bessere Hemmstärke von 82 dienen, woraufhin eine weitere optische Analyse der Lage und des Raumanspruchs der Liganden im Inneren der Pore erfolgte. Diese Betrachtung nahm die SASA als Maßstab für den Platzbedarf der Inhibitoren. Es zeigte sich, dass 82 durch seine die Pore durchspannende Konformation, selbige nahezu vollständig blockiert, wohingegen 96 nur einen Teil versperrt. (Vgl. unterschiedliche Ausdehnung der Liganden 82 und 96 in Abbildung 49, rechts) Diese Information über den sterischen Anspruch der Liganden im Inneren der β Tryptase und die daraus resultierende teilweise, beziehungsweise vollständige Besetzung der Pore konnte als Begründung des Unterschieds in der Hemmwirkung der Isomere herangezogen werden. Die Realisierung der Simulation der sehr flexiblen Liganden durch die selbst entwickelte Technik des sukzessiven Dockings, unter Berücksichtigung bestehender experimenteller Befunde, konnte somit erfolgreich ein neues, die Eigenschaften dieser beiden Liganden erklärendes Bindungsmodell generieren. 1.3. 14-3-3 – Ligandendesign durch virtuelle Retrosynthese Das letzte in dieser Arbeit beschriebene Projekt fokussierte auf der Entwicklung eines Liganden für die Dimerisierungsfläche der 14-3-3ζ Adapterproteins. Da sich bislang in der Literatur keine Beispiele für Binder der Dimerisierungsfläche finden, wurde als Ausgangspunkt für die Generierung ein breit angelegtes UV/Vis-Screening genutzt, bei welchem 70 kationische Verbindungen gegen die ζ-Isoform getestet wurden. Eine der vielversprechendsten Verbindungen in dem Screening war 54. Von diesem initial gefundenen Liganden wurde durch retrosynthetische, dockingbasierte Analyse (vgl. Abbildung 36, S. 63) ein bindungsrelevantes Fragment identifiziert. Dieses Fragment wurde daraufhin durch Variation seiner Ladung derivatisiert. Das Derivat mit der günstigsten Pose und dem besten Score dieser Analyse war Verbindung 118. Die gefundene Pose an der Dimerisierungsfläche konnte durch ein Epitopsy nochmals bestätigt werden. Basierend auf diesen Simulationsergebnissen wurde der Ligand synthetisiert und seine Bindungseigenschaften über eine UV/Vis- und MST-Titration erhoben: KD = 530 nM, UV/Vis und KD = 662 nM, MST. Ein Job Plot ergab die Stöchiometrie von 1:1 des Komplexes zwischen 118 und dimerem 14-3-3ζ, wodurch sich das Ergebnis der zuvor durchgeführten Simulationen bestätigte. Die genaue Lage und Konformation des Liganden war von größtem Interesse, weshalb der Versuch der Kristallisation von 118 in seiner Bindung zum Protein durchgeführt wurde. Die Kristallisation verlief erfolgreich, jedoch bildete das Beugungsmuster der röntgenspektroskopischen Untersuchung des Kristalls den Liganden mit einer sehr geringen Auflösung ab. Deutlich zu erkennen war die Lage des Liganden inmitten der sich in der Dimerisierungsfläche bildenden Pore. Nicht abgebildet wurde seine genaue Konformation, sowie sein Protonierungsgrad. Zur Ermittlung des Protonierungsgrads des Liganden in gebundenem Zustand wurden die pKa-Werte der protonierbaren Gruppen von Grad mit dem Programm PROPKA ermittelt. Hieraus ergab sich für die GCP- und Lysin-Amino-Gruppe ein pKa-Wert von 6.4, wodurch anzunehmen ist, dass 118 im nicht-protonierten, also ungeladenen, Zustand bindet. Die Optimierung der Kristallstruktur erfolgte daraufhin durch QM/MM MD Simulationen, welche von Mittal durchgeführt wurden. Mithilfe dieser Optimierung und den Informationen über den Protonierungsgrad konnte ein sehr genaues Bild des Liganden zwischen den Monomeren des 14-3-3ζ Proteins erstellt werden. Den Studien zufolge bindet der Ligand an der Dimerisierungsoberfläche, die ermittelten Interaktionen des Liganden bilden sich hauptsächlich zwischen dessen Lysin und einem Monomer. Das andere Monomer wird derweil durch die GCP-Gruppe gebunden. In diesem Projekt wurde durch virtuelle Retrosynthese erfolgreich ein Ligand für eine biologisch relevante Position an 14-3-3ζ entwickelt, welche zuvor noch keine Beschreibung in der Literatur fand. Die Illustration in Abbildung 50 zeigt zusammenfassend den Verlauf des Ligandendesigns von dem initialen Fund bis zur optimierten Kristallstruktur. Die denkbaren Entwicklungsmöglichkeiten dieses Systems sind vielfältig und werden in zukünftigen Studien dazu beitragen, die Funktion und Steuerung dieser Proteinfamilie besser zu verstehen. Einige der Entwicklungs- und Analysemöglichkeiten zur Erhöhung der Spezifität zwischen den humanen Isoformen oder zur Modulation von Heterodimerisierung verschiedener Isoformen wurden in Kapitel 7.4 (ab S. 72) vorgestellt. Die zur fortschreitenden Entwicklung von 118 berechneten Derivate (118.1 - 118.11, Abbildung 47, S. 78) konnten durch die Ergebnisse der QM/MM MD Simulationen und durch Verwendung der Core-Funktion von Glide innerhalb der Pore und nahe der Konformation von 118 an 14-3-3ζ berechnet werden. Innerhalb dieser Derivate schnitten 118.4 - 118.7, welche zur Steigerung der Affinität zur ζ-Isoform generiert wurden, im Docking tatsächlich besser ab. Im Rahmen der Simulationen dieser zweiten Generation an Bindern der Dimerisierungsfläche der 14-3-3 Proteine konnten Indizien für eine mögliche Isoformspezifität ausgearbeitet werden. Diese können in weiterführenden Arbeiten an diesem Projekt zur Entwicklung spezifischer Liganden zur Adressierung der verschiedenen Isoformen und Dimerisierungsvarianten von Nutzen sein.

9. Summary of Projects The summary of the single projects of this dissertation will be presented in three subsec-tions. 9.1. SARS CoV Mpro – Design of a Potential Inhibitor of Dimerization This project aimed at the development of an inhibition mechanism which uses the suppression of the dimerization process of the protease SARS CoV Mpro, which is essential for its activity. The inspection of the relevant protein surface inside the dimerization interface was done optically and with the aid of the program AutoLigand. Hereby a volume within the protein cavity was defined for the design of a potential binder. Inside this volume, different surface characteristics which the potential binder might address were identified. As the central interaction point, Arg 4 was established. Because of its exposed position on the protein surface, as well as the surrounding topography, it seemed to be a good target for small molecule binders. A second point of interest is the fact that Arg 4 is vital for the dimerization of the protein. Due to its exposed position, the sidechain of Arg 4 has enough surrounding space to allow an artificial receptor unit to bind. The bisphosphonate tweezer (BP), developed by Schrader, was chosen as the Guanidine receptor. Besides a strong binding affinity for Guani-dine, the charge on the BP tweezer can be adjusted from 0 to -4 by methyl esterification. The BP was derivated virtually with different fragments which might bind to an aromatic pocket next to the Arg 4. Additionally, it was sought to design a moiety which could be used as somewhat of a surface mimicry of the surrounding topography in order to allow the potential ligand to gain more stability in its bound pose. To reach these goals, the BP has been derivatized by combinations of aromatic residues, like His, Phe and Trp, which were connected to the receptor unit using Gly or N-Ala as a linker. The resulting small library was tested with docking and cluster analysis. The best candidate obtained by this study was BP(OMe)-Gly-Phe; it outshone the rest of the investigated group because it showed relevant aspects of the design criteria. In its docked pose, BP was complexing the Arg 4 and the phenyl ring of Phe was inside the aromatic pocket, while the ligand’s C-terminal was exposed to solvent. (See figure 15, p. 37) Due to this, the further ligand development could be done without changing the position of this initial stance. In the second step of the design process, the con-ceptional ligand was elongated with a GuaCbz or O-Bn moiety as a potential surface mimicry, while the linker was modified. The resulting group of candidates has been investigated by docking techniques. The best binder in the docking study was the ligand BP-Phe-GuaCbz; it presented a pose which met all design criteria: BP was complexing Arg 4, Phe was positioned inside the aromatic pocket and the GuaCbz moiety huddled against the protein surface. This pose was additionally stabilized through two intramolecular hydrogen bonds and gave a promising docking score. To estimate if the ligand’s binding affinity can compete against the affinity of dimerization, their binding energies have been compared mathematically. The ΔGbind of the ligand to the protein was simulated to be -9.13 kcal/mol, while the dimerization constant of the protease (KD = 100 μM) gave a ΔGbind of -5.37 kcal/mol. From this rough comparison, it can be said that the ligand can bind to the protein more strongly than the protein to itself. In principle, the ligand BP-Phe-GuaCbz should be able to suppress the dimerization of the SARS CoV Mpro and hence its enzymatic activity. (See figure 51) The virtual de novo design of new ligands is a powerful tool for ligand development and it can be used to address a wide range of targets. The developed method of mechanistically suppressing the activity of an essential protease of a pathogen by the inhibition of the crucial dimerization process of the target enzyme is an elegant and promising strategy. 9.2. β-Tryptase – Evolution of a Binding Model The advancement of an existing binding model for the adaptation of experimental data was the focus of this project. The existing model included a possible inhibition mechanism for four-armed ligands, which were blocking the pore of the tetrameric protease β-Tryptase by attaching themselves to residues at the entrance of that pore. Therefore, a potential substrate would not be able to enter the pore and reach the active sites, which leads to an inhibition of enzymatic catalysis. Unfortunately, this model was not able to explain the differing behaviour of two three-armed sequential isomers. (82, Ki = 22,5 nM and 96, Ki =114 nM, compare figurAbbildung 20, p. 47) The two isomers could, in principle, block the central pore in a similar way to the four-armed variants. The experiments showed that 82 and 96 were inhibiting the enzyme in a non-competitive way. Heider revealed additional binding spots for this kind of inhibitor inside the central pore of the tetrameric protease close to its active site or the oligomerization areas, respectively. This information, combined with the inhibitory strength of the two ligands, should be incorporated into the new binding model. (See figure 52) Because of the large size and flexibility of the ligands 82 and 96, the virtual analysis of pos-sible binding modes was done with truncated parts of the ligands, using the software Glide. These truncated model ligands had been reduced to their central scaffold featuring just one arm instead of three. The model ligand was docked to the protein surface inside the cavity of the protease. In order to do so, three enclosing boxes were positioned in a way that they covered the residues at the entrance of the pore and the binding spots discovered by Heider. Additionally, the boxes were engaged in an overlapping manner, to ensure that binding posi-tions at the border in between the boxes could be found by the docking algorithm as well. To respect the non-competitive mode of inhibition, the function Excluded Volumes, imple-mented in Glide, was used to deter the ligands from entering the active sides. During the docking process, the central scaffold of the model ligands was held in the middle of the protein’s pocket. The protein surface inside the cavity was then scanned with the single-armed ligand using the established settings. After the docking of the single-armed variants, the the best results of each variant were combined, overlapping at their central scaffold, in order to build up the real ligands 82 and 96 inside the protein’s pore. After this combination, the resulting poses were passed through a conformational search to prove their stability and to gain information about their binding energies. The mean score from the docking of the model ligands and the predicted binding energies were compared; they showed a score which was 1 kcal/mol better for ligand 82 than for 96, but a binding energy which was 12 kcal/mol worse compared to 96. This energetic evaluation did not answer the question about the inhi-bition strength, which differed by a factor of 5. To shed light onto this significant inhibitory difference, the SASA (solvent accessible surface area) of the two poses taken by the inhibi-tors inside the protein pore was investigated. While the pose of 82 is very bulky and blocks the pore nearly completely, the pose of 96 blocks only about half of the pore. (Compare the required space of the poses in figure 52, right) The information about the steric demands of the positions and the resulting partial or total blocking of the pore, respectively, can be used to explain the altered inhibitory strengths of the two isomers 82 and 96. The self-developed method of successive docking was used effectively to advance the binding model and explain the variances in inhibition of the two similar compounds.  9.3. 14-3-3 – Ligand Design by Virtual Retrosynthesis The last project in this thesis was focusing on the development of a ligand for the dimerization interface of the 14-3-3 adapter protein. Until now, no examples of this kind of ligand are shown in literature, therefore a UV/Vis screening of 70 cationic compounds against 14 3-3ζ was used as the starting point for the design process. One of the most promising candidates revealed by this screening was compound 54. Carrying on from this initial hit, a fragment relevant to binding was identified by docking-based virtual retrosynthesis. This fragment was then derivatised by varying its charges. The resulting derivates are then passed through a docking analysis. The candidate which performed best in this docking, concerning score and pose, was compound 118. The desired position at the dimer interface of 14-3-3ζ was additionally confirmed by an Epitopsy scan. The compound was then synthesized and its binding affinity, as well as the stoichiometry, investigated by UV/Vis and MST techniques, revealing a KD of 530 nM (UV/Vis) or 662 nM (MST), respectively. The stoichiometry was found to be 1:1 with respect to the 14-3-3ζ dimer concentration using the Job Plot method, indicating the ligand to bind to the dimer and not to the single monomer. The exact ligand position and its conformation upon binding to 14-3-3ζ were investigated by X-ray crystallography, and 118 was shown by this technique to lie in between the dimer interface. The resolution of the crystal structure was quite low, so a QM/MM MD refinement of the crystal structure was performed by Mittal. In addition, Grad performed pKa predictions combined with a virtual alanine scan to elucidate the protonation state of the bound ligand inside the dimerization interface. These results presented the ligand in an uncharged state binding both monomers at the same time. Possible further development opportunities for this system are plentiful and are expected to contribute significantly to the understanding and regulation of this protein family. Some of the prospects for the evolution and analysis for increasing the specificity between the human isoforms or the modulation of the heterodimerization of varying isoforms have been discussed in detail in chapter 7.4 (p. 69). Derivatives investigated for the burgeoning of 118 (118.1- 118.11, picture 47, p. 75) could be calculated within the cavity and close to the conformation of 118 bound to 14-3-3ζ using the results of QM/MM MD simulations and the Core-function within the Glide software. Within the plethora of deriva-tives, 118.4 – 118.7 were found to score highly in the docking studies, which confirmed the initial outlook of them being developed with intention of increasing the affinity for the ζ-isoform. During the simulation of the second generation of binders at the dimerization interface of the 14-3-3 protein, indications pointing towards isoform specificity arose. During this project, a small molecule binder for a biologically relevant position inside the 14 3 3ζ adapter protein was found, developed by virtual retrosynthesis. (Compare figure 53) Its binding parameters were obtained using UV/Vis and MST titrations. Additionally, a QM/MM MD re-finement was used to investigate the interactions between 118 and the protein dimer. In the future, this promising result might lead to specific ligands for the individual isoforms and their hetero- or homo dimers, respectively.

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Ehlers, Martin: Simulationen supramolekularer Systeme. 2017.

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