Struktur-Wirkungs-Beziehung peptidischer Guanidiniocarbonylpyrrol-Liganden zur nicht-viralen Gentransfektion – ein Balanceakt über einen Hindernisparcours

Junghänel, Sandra

Guanidiniocarbonylpyrrol(GCP)-tragende peptidische di-, tri- und tetravalente Liganden wurden auf ihre Eignung als Transfektionsvektoren und den dabei zugrundeliegenden Transfektionsmechanismus untersucht. Durch gezielte strukturelle Modifikationen wurden neue Vektoren synthetisiert und unterschiedliche Aspekte der durch sie vermittelte Transfektion ausgeleuchtet, um den Einfluss der unterschiedlichen strukturellen Variationen auf die Affinität zur DNA, das Kondensationspotenzial, die Transfektionseffizienz, den zugrundeliegenden Aufnahmemechanismus, die Pufferkapazität oder die Auswirkung auf die Toxizität zu untersuchen. Die GCP-Gruppe zeigte sich für diesen neuartigen und kleinen Vektortyp als essenziell notwendig, um eine erfolgreiche Transfektion und Exprimierung des GFP zu vermitteln. Die GCP-Liganden waren im Gegensatz zu strukturell sehr ähnlichen Ligaden, die allerdings nur aus natürlichen Aminosäuren aufgebaut sind und als Transfektionsvektoren vollkommen versagten, sehr effiziente Werkzeuge, um fremdes Erbgut erfolgreich in Zellen einzubringen. Die GCP-Gruppen trugen zur exzellenten DNA-Erkennung und -Kondensation bei, vermittelten durch ihre Pufferkapazität das endosomalen Entkommen und schützten die transportierten Plasmide vor dem enzymatischen Abbau. Die Erhöhung der Affinität solcher GCP-tragender Liganden für DNA, z. B. durch eine optimierte Aminosäuresequenz oder die Erhöhung der Valenz auf ein vierarmiges System ließ keine Optimierung. Die Einführung reduktionslabiler disulfidischer Linker-Gruppen gezeigte, dass die zu hohe Bindungsaffinität die Transfektionseffizienz begrenzt. Diese GCP-Liganden waren in der Lage intrazellulär zu weniger affinen Fragmenten zu zerfallen, sodass sich wieder hohe Transfektionseffizienzen beobachten ließen. Die Hybridisierung peptidischer GCP-tragender Liganden mit aliphatischen Molekülteilen (langen Alkylketten oder Cholesterol) bewirkte dagegen nur gesteigerte membranolytische Eigenschaften, ohne nennenswertes Transfektionspotenzial. Allein die Einführung des kleinen Adamantyl-Ankers konnte die Transfektionseigenschaften positiv beeinflussen. Zum einen war bereits bei verminderter Konzentration eine erfolgreiche Transfektion induziert worden, zum anderen war dieser Hybridvektor in der Lage, auch die resistenteren HeLa-Kyoto-Zellen sehr erfolgreich zu transfizieren. Unterstützend wurden zusätzlich alle Liganden mithilfe der hier ebenfalls etablierten fluoreszierenden, nicht-kovalenten DNA-Sonde untersucht und intrazellulär verfolgt. Die deutlich unterschiedlichen Bilder, die dabei erhalten wurden, je nachdem welcher Transfektionsvektor eingesetzt wurde, bewiesen, dass der Aufbau von supramolekularen ternären Komplexen gelungen war, die sogar über die Membranpassage hinaus noch zu bestehen schienen.

Guanidiniocarbonylpyrrole(GCP)-carrying peptide ligands were investigated for their suitability as transfection vectors and their underlying mechanism of transfection. New vectors were synthesized by specific structural modifications to determine different aspects of transfection namely the influence of different structural variations on affinity for DNA, condensation potential, transfection efficiency, underlying uptake mechanism, buffering capacity, or toxicity. The GCP group is essential for this novel and small vector type to mediate a successful transfection and expression of the GFP. These GCP-ligands, in contrast to structurally very similar ligands, which were only composed of natural amino acids and failed completely as transfection vectors, became very efficient tools for successfully introducing foreign genes into cells. The GCP groups contributed to recognition and condensation of the DNA, introduced the endosomal escape by their buffering capacity and protected the plasmids from enzymatic degradation. The increase in the affinity of such GCP-bearing ligands for DNA, e. g. by an optimized amino acid sequence, or the enhancement of the valence on a four-armed system did not lead to systems optimization. The introduction of labile disulfide linker groups has shown that binding affinity which was too high limited the transfection efficiency. GCP-Ligands, which were able to decompose intracellularly to less affine ligands by the labile disulfide linkers, again showed high transfection efficiencies. Hybridization of peptidic GCP-bearing ligands with aliphatic moieties (long alkyl chains or cholesterol) only produced enhanced membranolytic properties, without any significant transfection potential. In contrast to that, the use of the small adamantyl anchor could positively influence the transfection properties. On the one hand, a successful transfection had already been induced at reduced concentrations; on the other hand, this hybrid vector was able to transfect even the more resistant HeLa-Kyoto cells very successfully. All ligands were supportively investigated and monitored intracellularly by the fluorescent, non-covalent DNA probe, which is also established here. The clearly differing images, which were obtained depending on the transfection vector used, proved that the construction of supramolecular ternary complexes had succeeded, which even seemed to persist beyond the membrane passage.

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Junghänel, Sandra: Struktur-Wirkungs-Beziehung peptidischer Guanidiniocarbonylpyrrol-Liganden zur nicht-viralen Gentransfektion – ein Balanceakt über einen Hindernisparcours. 2017.

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