The effect of organic solvents on biofilm formation of the thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Benninghoff, Jens Carlo GND

Sulfolobus acidocaldarius is a thermoacidophilic Crenarchaeon (78°C and pH 2-3) with established genetic systems. With these properties, S. acidocaldarius offers high potential for biotechnological applications as alternative host for the production of bulk and fine chemicals, solvents and second generation biofuels, which are, however, often toxic to cells. Biofilms, the dominant lifestyle of microorganisms, were shown to confer higher resistance towards solvent exposure and hence turn more and more into research focus for biotechnological applications. Although S. acidocaldarius is known to form biofilms, the development of suitable incubation systems is still in its beginning and also the influence of organic solvents on S. acidocaldarius has only rarely been studied. In this work, incubation systems for the cultivation of submerse biofilms of S. acidocaldarius cells on glass and polystyrene surfaces in microtiter plates, μ- and Petri-dishes as well as a flow-through system were successfully developed and optimized. These newly developed methods enabled detailed microscopic analyses and also yielded sufficient amounts of biofilms for isolation and analyses of extracellular polymeric substances (EPS) as well as for application of various -omics methods. The analyses were performed in presence and absence of organic solvents (with special respect to 1-butanol) and the results were compared to shaking cultures. S. acidocaldarius formed biofilms even in shaking cultures in Erlenmeyer flasks at the liquid/glass/air interface as a (stress)response to sublethal concentration of different solvents. In accordance with shaking cultures, in a 96-well plate static incubation system, the tendency of enhanced biofilm formation as a response to sublethal concentrations of 1-butanol (<1.5% (v/v)) was visible. By the use of an adapted resazurin assay, indicating respiratory activity, the viability of biofilm cells was confirmed colorimetrically. Furthermore, in static incubation systems e.g. on glass slides, S. acidocaldarius formed monolayered biofilms of homogenously distributed cells even in the absence of solvents as shown by crystal violet staining and subsequent light microscopy. In the presence of solvents these biofilms appeared thicker and showed an altered morphology with a heterogenous distribution and cell aggregate formation, indicated by enhanced crystal violet binding. Additionally, visualised by scanning electron microscopy, under 1.5% (v/v) 1-butanol exposure the aggregated cells were surrounded by extracellular material, probable EPS. Furthermore, the cell morphology was altered compared to the control experiments showing a diversified cell envelope with holes. In the presence of 1% (v/v) 1-butanol, less changes in biofilm morphology and no changes in cell morphology were observed by the application of atomic force microscopy. Lectin binding and subsequent confocal laser-scanning microscopy of submersed biofilms showed an increased amount of carbohydrate structures, especially α-mannopyranosyl- and α-glucopyranosyl residues. The enhanced EPS formation was also confirmed by EPS isolation and quantitative determination using colorimetric assays, which showed a 5-fold increase of carbohydrates within the extracted EPS. The amount of proteins was even 19-fold higher compared to the control without butanol, indicating that EPS formation in biofilms is significantly increased in the presence of toxic solvent concentration. Beside the influence of 1-butanol on changes in biofilm morphology and EPS formation, the response of S. acidocaldarius towards changes in lifestyle and 1-butanol was investigated by transcriptomic and proteomic studies. For this, S. acidocaldarius was cultivated as shaking culture in Erlenmeyer flasks without 1-butanol exposure and statically in Petri-dishes for biofilm and planktonic growth in the absence and presence of 1-butanol. Statically grown biofilm and planktonic cells in Petri-dishes showed only less differentially regulated genes and proteins. Lots of differentially regulated genes and proteins were found in cells of shaking cultures and statically incubated planktonic cells. In the presence of 1% (v/v) 1-butanol, genes and proteins are predominantly down-regulated, especially proteins containing transmembrane helices, confirmed by transcriptomic analyses. In planktonic as well as biofilm cells in the presence of 1-butanol, the archaellum operon, responsible for cell motility, was down-regulated. Generally, in response to 1-butanol and different lifestyles, changes in cell division and vesicle formation, stress response systems like the CRISPR-Cas and toxin-antitoxin system, transcriptional regulators and protein kinases and phosphatases (signal transduction) were observed. In conclusion, this study gives an overview of the stress response of S. acidocaldarius towards organic solvents and 1-butanol in detail. For the first time the influence of organic solvents on biofilm formation was described and investigated by various microscopic methods and EPS isolation and quantification. In addition, transcriptomic and proteomic studies were performed to investigate genome-wide and cellular responses towards different lifestyles and 1-butanol.

Sulfolobus acidocaldarius ist ein gut charakterisiertes, thermoazidophiles und obligat aerobes Crenarchaeon mit optimalen Wachstumsbedingungen bei 78°C und einem pH 2-3. Zudem ist dieser Organismus genetisch manipulierbar. Mit diesen Eigenschaften birgt S. acidocaldarius daher ein großes Potenzial für biotechnologische Anwendungen als alternativen Produktionsstamm für Massen-und Feinchemikalien, Lösemittel und Biotreibstoffe der zweiten Generation, welche oft toxisch für die Zellen sind. Biofilme, die vorwiegende Lebensweise von Mikroorganismen, besitzen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit bei Lösemittelexposition und erzielen dadurch ein steigendes Forschungsinteresse für biotechnologische Anwendungen. Obwohl bekannt ist, dass S. acidocaldarius Biofilme bildet, ist die Entwicklung geeigneter Inkubationssysteme noch am Anfang und der Einfluss von organischen Lösemitteln auf S. acidocaldarius ist kaum untersucht. In dieser Arbeit wurden erfolgreich Inkubationssysteme für die Kultivierung von Unterwasser-Biofilmen von S. acidocaldarius auf Glas- und Polystyrol-Oberflächen in Mikrotiterplatten, μ- und Petri-Schalen sowie Durchflusssysteme entwickelt und optimiert. Die neu entwickelten Methoden ermöglichten sodann detaillierte mikroskopische Untersuchungen und erzeugten ausreichende Mengen an Biofilmen für die Isolation und Analyse von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) sowie der Anwendung verschiedener „Omics“-Methoden. Die Untersuchungen wurden in An- und Abwesenheit organischer Lösemittel durchgeführt mit Hauptaugenmerk auf 1-Butanol. Die Resultate wurden mit Schüttelkulturen verglichen. In Schüttelkulturen (Erlenmeyer-Kolben) erzeugte S. acidocaldarius Biofilme an der Flüssigkeit/Glas/Luft Zwischenphase als (Stress-)Antwort auf Lösemittelkonzentrationen unterhalb der Wachstumsinhibition. Im Einklang zu den Schüttelkulturen war bei der statischen Inkubation in 96-well-Mikrotiterplatten eine Tendenz zur erhöhten Biofilmbildung in subletalen 1-Butanol Konzentrationen (<1.5%) sichtbar. Durch die Verwendung eines adaptierten Resazurin Versuchs, welcher die Atmungskettenaktivität der Zellen nachweist, wurde die Viabilität der Zellen durch Farbänderungen nachgewiesen. Weiterhin wurde in statischen Inkubationssystemen, z. B. auf Glasplättchen, durch Kristallviolettfärbung und Lichtmikroskopie gezeigt, dass S. acidocaldarius Biofilme bildete, dessen Zellen gleichmäßig verteilt waren. In Anwesenheit von Lösemitteln sahen die Biofilme durch erhöhte Kristallviolettbildung dicker aus und zeigten eine veränderte, ungleichmäßige Zellverteilung und eine Bildung von Aggregaten. Zusätzlich wurden die Biofilme mit Elektronenmikroskopie untersucht, wobei bei der Exposition mit 1,5% (v/v) 1-Butanol die aggregierten Zellen mit extrazellulärem Material, wahrscheinlich EPS, umgeben waren. Zudem wurde eine, im Vergleich zu den Kontrollen, veränderte Zellmorphologie beobachtet, die sich durch Löchern auf der Zelloberfläche zeigte. Bei der Inkubation mit 1% (v/v) 1-Butanol wurden durch Rasterkraftmikroskopie nur wenig Änderungen des Biofilms und keine Änderungen der Zellen beobachtet. Die Lektinbindung und konfokale Laserrastermikroskopie von Unterwasserbiofilmen zeigte eine erhöhte Anzahl an Kohlenhydratstrukturen, vorwiegend α-Mannosyl- und α-Glukopyrannosyl-Resten. Die erhöhte EPS-Bildung wurde ebenfalls durch EPS-Isolation und Quantifizierung durch Farbtests gezeigt, wobei ein 5-facher Anstieg von Kohlenhydraten in der EPS gemessen wurde. Da die Anzahl an Proteinen, im Vergleich zur Kontrolle ohne 1-Butanol-Exposition, sogar 19-fach erhöht war, zeigte sich, dass die EPS-Bildung in Biofilmen bei der Anwesenheit toxischer Lösemittelkonzentrationen signifikant erhöht ist. Neben dem Einfluss von 1-Butanol auf Änderungen in Biofilmmorphologie und EPS-Bildung wurden die Änderungen von S. acidocaldarius in verschiedenen Lebensweisen sowie gegenüber 1-Butanol durch Transkriptom- und Proteomuntersuchungen bestimmt. Hierfür wurde S. acidocaldarius zum einen als Schüttelkulturen in Erlenmeyerkolben ohne 1-Butanol als auch statisch in Petri-Schalen für Wachstum von Biofilm und planktonischen Zellen in An- und Abwesenheit von 1-Butanol gezüchtet. Statisch gewachsene Biofilm- und planktonische Zellen in Petri-Schalen zeigten lediglich wenig differenziell regulierte Gene und Proteine. Viele differenziell regulierten Gene und Proteine wurden hingegen beim Vergleich von statisch inkubierten planktonischen Zellen sowie planktonischen Zellen aus Schüttelkulturen gefunden. In Anwesenheit von 1% (v/v) 1-Butanol sind Gene und Proteine vorwiegend herabreguliert, besonders Proteine mit (putativen) Transmembranhelices, wie durch Transkriptomuntersuchungen gezeigt werden konnte. Sowohl in Biofilm- als auch in planktonischen Zellen war das Archaellum Operon, welches für die Zellbeweglichkeit verantwortlich ist, herabreguliert. Grundsätzlich wurden sowohl bei 1-Butanol-Exposition als auch bei den verschiedenen Lebensweisen besonders Änderungen in der Zellteilung und Vesikelbildung, in den Stressantwort-Systemen wie CRISPR-Cas und Toxin-Antitoxin-Systemen, bei Transkriptionsregulatoren sowie der Signaltransduktion (Proteinkinasen und Phosphatasen) beobachtet. Zusammengefasst zeigt diese Studie eine Übersicht der Stressantwort von S. acidocaldarius gegenüber verschiedener Lösemittel, insbesondere gegenüber 1-Butanol. Erstmalig wurde der Einfluss organischer Lösemittel auf die Biofilmbildung beschrieben und durch verschiedene mikroskopische Methoden sowie EPS-Isolation und Quantifizierung untersucht. Zusätzlich wurden durch Transkriptom- und Proteomuntersuchungen die genomweiten sowie zellulären Antworten auf verschiedene Lebensweisen und auf 1-Butanol-Exposition untersucht.

Cite

Citation style:
Benninghoff, J.C., 2020. The effect of organic solvents on biofilm formation of the thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus acidocaldarius. https://doi.org/10.17185/duepublico/43311
Could not load citation form.

Rights

Export