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Functional analysis of the interactions of the spindle assembly checkpoint proteins BubR1 and Bub1 at the kinetochore

Overlack, Katharina

Cell division or loss of sister chromatid cohesion prior to achievement of bi-orientation leads to missegregation of chromosomes and causes aneuploidy, which is closely associated with tumorigenesis. To prevent this, the Spindle Assembly Checkpoint (SAC) monitors correct attachment of spindle microtubules to kinetochores (large protein assemblies on centromeric DNA) and coordinates this with cell cycle progression. Bub1 and BubR1, essential SAC components, evolved through several duplication events from an ancestor gene creating two structurally related gene products with highly diversified functions. Previously, BubR1 has been shown to depend on Bub1 for its kinetochore localization, whereas Bub1 localizes to kinetochores independently of BubR1. However, the molecular basis for such differences in recruitment has been unclear, as Bub1 and BubR1 both bind to Bub3, a targeting adaptor for phosphorylated kinetochores. In my PhD project, the basis of the different localization behavior has been identified. I demonstrated that Bub1, but not BubR1, enhances binding of Bub3 to phosphorylated kinetochores via a short motif in its Bub3-binding domain (B3BD) called the "loop". This provided an explanation for why BubR1 relies on an alternative mechanism for kinetochore localization. Consequently, swapping loops created a loss-of-function Bub1, impaired in kinetochore localization, and a gain-of-function BubR1, localizing to kinetochores independently of Bub1. However, the inability of the loop-swap mutant of BubR1 to retain BubR1 SAC function led to the subsequent identification of the specific role of the BubR1-loop. In vivo and in vitro experiments established that the unique sequence of the BubR1-loop promotes binding of BubR1 to the APC/C. Additionally, this study showed for the first time that kinetochore localization of BubR1 relies on a direct interaction with Bub1. Hetero-dimerization requires structurally equivalent domains in both proteins, the B3BD and a subsequent helical segment. Furthermore, both proteins need to be bound to Bub3 for this interaction to take place. Interestingly, hetero-dimerization of Bub1 and BubR1 did not require kinetochores. Collectively, my PhD work illustrates how gene duplication and subsequent sub-functionalization determine the differences in the behavior of two closely related proteins as part of an essential molecular network providing a further step in our understanding of how the checkpoint signal is generated at the molecular level.

Für die Zellteilung ist es wichtig, dass die Chromosomen über große Proteinkomplexe (sogenannte Kinetochore) richtig an die mitotische Spindel angeheftet sind. Fehler bei der Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen können zu einer veränderten Chromosomenanzahl führen. Solche sogenannten "Aneuploidien" sind eng mit der Entstehung von Tumoren verknüpft. Der "Spindle Assembly Checkpoint (SAC)" hat sich als essentieller Kontrollmechanismus entwickelt, um Fehler bei der Chromosomenverteilung zu verhindern. Der SAC überwacht die korrekte Anheftung der Mikrotubuli der mitotischen Spindel an die Kinetochore und synchronisiert dies mit dem Voranschreiten der Zelle im Zellzyklus. Bub1 und BubR1 sind wichtige Bestandteile des SAC, die sich durch mehrere Genduplikationen aus einem gemeinsamen Vorläufergen entwickelt haben. So sind zwei Genprodukte mit sehr ähnlichem Aufbau, aber unterschiedlichen Funktionen entstanden. Bisher ist bekannt, dass die Kinetochor-Lokalisation von BubR1 von der vorherigen Anwesenheit Bub1s abhängt, die Kinetochor-Lokalisation von Bub1 jedoch unabhängig von BubR1 ist. Die molekulare Grundlage für diese Unterschiede im Rekrutierungsmechanismus von Bub1 und BubR1 war jedoch bisher unbekannt, da beide Proteine an Bub3, ein Adapterprotein für phosphorylierte Kinetochore, binden. In dieser Doktorarbeit wurde die Grundlage für das unterschiedliche Verhalten identifiziert. Bub1, jedoch nicht BubR1, verstärkt die Bindung von Bub3 an phosphorylierte Kinetochore durch eine kurze Region in der Bub3-Bindedomäne von Bub1, die "Loop" genannt wird. Dies erklärt warum BubR1 über einen alternativen Weg ans Kinetochor gelangen muss. Der Austausch der Loops zwischen Bub1 und BubR1 bewirkte einen Funktionsverlust von Bub1, welches nicht mehr in der Lage war am Kinetochor zu lokalisieren und einen Funktionsgewinn von BubR1, das so unabhängig von Bub1 ans Kinetochor gelangen konnte. Die Beobachtung, dass diese Loop-Austausch-Mutante von BubR1 jedoch nicht in der Lage war die SAC Funktion von BubR1 zu erfüllen, führte zur Identifikation der genauen Funktion des Loops in BubR1. In vivo und in vitro Experimente haben gezeigt, dass die besondere Sequenz des BubR1 Loops eine entscheidende Rolle in der Vermittlung der Bindung von BubR1 an den APC/C spielt. Ferner wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine direkte Interaktion zwischen Bub1 und BubR1 Voraussetzung für die Kinetochor-Lokalisation von BubR1 ist. Diese Heterodimerisierung erfordert strukturell equivalente Domänen in beiden Proteinen, zum einen die Bub3-Bindedomäne und zum anderen eine Region, die sich direkt an die Bub3-Bindedomäne anschließt und eine Helix bilden soll. Des Weiteren müssen Bub1 und BubR1 für ihre Interaktion an Bub3 gebunden sein. Interessanterweise kann die Heterodimerisierung auch ohne Kinetochore stattfinden. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit wie Genduplikation und die anschließende Subfunktionalisierung die Unterschiede im Verhalten von zwei eng verwandten Proteinen, die beide Teil eines essentiellen molekularen Netzwerkes sind, entscheidend beeinflussen können. Dies liefert ein tiefergehendes Verständnis darüber, wie das SAC Signal auf molekularer Ebene erzeugt wird.

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Overlack, Katharina: Functional analysis of the interactions of the spindle assembly checkpoint proteins BubR1 and Bub1 at the kinetochore. 2017.

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