Räumlich-zeitliche Regulation von Rho-GTPase Netzwerken

Koch, Johannes GND

Die präzise Koordination der Aktivitäten von Rac1, Cdc42 und RhoA sowie ihre gegenseitige Beeinflussung werden als wichtige regulatorische Mechanismen für die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts betrachtet. Dabei verhalten sich Rac1 und Cdc42 oft kooperativ, während zwischen RhoA und Rac1 bzw. Cdc42 meist ein Antagonismus beobachtet wird. Die genaue Topologie von Rho-GTPase Netzwerken in unterschiedlichen zellulären Prozessen ist noch nicht entschlüsselt. Jedoch wurden kürzlich subzelluläre Rho Aktivitätsoszillationen beschrieben, welche lokale Oszillationen von Aktomyosin-Kontraktionen erzeugen. In dieser Arbeit wurden die räumliche und zeitliche Regulation dieser Rho Aktivitätsoszillationen sowie die gegenseitige Kontrolle der drei Rho-GTPase Aktivitäten systematisch untersucht. Die Expression von aktiven Rho-Mutanten induzierte eine Suppression der Rho Aktivitätsoszillationen, was für eine zentrale Rolle von Rho in dem regulatorischen Netzwerk spricht. Die Aktivierung des Rho spezifischen GEFs GEF-H1 bewirkte eine Verstärkung der Aktivitätsoszillationen, und ihre wellenartige Ausbreitung. Im Gegenzug führte die Depletion dieses GEFs zur Inhibition der Oszillationen. Die Wellenausbreitung deutet darauf hin, dass GEF-H1 als Teil eines Aktivator-Inhibitor Netzwerks durch ein positives Feedback die Aktivität von Rho stimuliert. Übereinstimmend damit korrelierte die Lokalisationsdynamik von GEF-H1 mit den Rho Aktivitätsoszillationen. Basierend auf der Überexpression einer aktiven Mutante sowie anhand von Kreuzkorrelationsanalysen der Aktivitätsmuster konnte gezeigt werden, dass der RhoGEF LARG das positive Feedback von Rho mit einem alternativen Mechanismus vermitteln kann. Ect2 scheint hingegen keine regulatorische Funktion in diesem Netzwerk zu haben. Als eine zusätzliche Ebene der Aktivitätskontrolle wurde im Folgenden die gegenseitige Regulation der Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA charakterisiert. Hierzu wurden, mittels chemisch induzierter Dimerisierung und Optogenetik, einzelne Rho-GTPasen akut aktiviert und die Antwort der anderen Rho-GTPasen mit fluoreszenzbasierten Aktivitätssensoren gemessen. Wider Erwarten konnte kein Antagonismus zwischen Rho und Rac1 bzw. Cdc42 detektiert werden. Stattdessen erhöhte die Stimulation von Rac1 die Aktivität von Rho signifikant. Diese positive Interaktion zwischen Rac1 und Rho könnte somit die Basis der bereits beobachteten kooperativen Kontrolle dynamischer Zellstrukturen darstellen.

Accurate coordination of Rac1, Cdc42 and RhoA activity as well as their mutual regulation are considered to be crucial mechanisms for the reorganization of the actin cytoskeleton. Thereby, Rac1 and Cdc42 often act cooperatively, whereas RhoA and Rac1 respectively RhoA and Cdc42 show antagonistic behaviour. The precise topology of Rho GTPases networks in distinct cellular processes has not been fully resolved yet. However, Rho activity oscillations which create local oscillations of actomyosin contraction were described recently. In this thesis the spatio-temporal regulation of these Rho activity oscillations as well as the mutual control of the three Rho GTPases were systematically analysed. Expression of active Rho mutants induced a suppression of Rho activity oscillations, which implies a key role of Rho in the regulatory network. Activation of the Rho-specific GEF GEF-H1 caused an enhancement of oscillatory behaviour and wave-like propagation. In return depletion of GEF-H1 resulted in an inhibition of activity oscillations. The observed wave propagation indicated that GEF-H1 is part of an activator-inhibitor network to elevate Rho activity through a positive feedback. Accordingly, the dynamic of GEF-H1 localization was found to correlate with Rho activity oscillations. Based on overexpression of an active mutant as well as cross-correlation analysis of activity patterns, the RhoGEF LARG was shown to mediate an alternative feedback mechanism to Rho. Conversely, Ect2 showed no regulatory function in this network. As an additional level of regulatory control, the cross-talk between the Rho GTPases Rac1, Cdc42 and RhoA was characterized. For this purpose, individual Rho GTPases were acutely activated by chemically induced dimerization and optogenetics while the response of the other Rho GTPases was measured via fluorescence-based activity sensors. Contrary to expectations no antagonism between Rho and Rac1 or Cdc42 could be detected. Instead, the stimulation of Rac1 significantly enhanced the activity of Rho. This positive interaction between Rac1 and Rho could possibly be the basis for the already observed cooperative control of dynamic actin-based structures in cells.

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Koch, Johannes: Räumlich-zeitliche Regulation von Rho-GTPase Netzwerken. 2020.

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