Während der enchondralen Ossifikation ist die geordnete Differenzierung von proliferierenden- zu hypertrophen Chondrozyten der entscheidende Schritt, der für das Auswachsen und die Länge des späteren Knochens verantwortlich ist. Zuerst bilden die Chondrozyten eine Knorpelzwischenstufe, die daraufhin durch Knochen ersetzt wird. Die Chondrozytendifferenzierung wird über ein komplexes Netzwerk von regulatorischen Molekülen, wie Transkriptionsfaktoren und Morphogenen, reguliert (Wuelling et al., 2013; Wuelling und Vortkamp, 2010). Bisherige Daten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass essentielle Transkriptionsfaktoren der Chondrozytendifferenzierung mit Histon-modifizierenden Enzymen interagieren und deren Aktivität regulieren (Wuelling et al., 2013). Weiterhin tritt im Verlauf der Chondrozytendifferenzierung ein globaler Anstieg der Histonacetylierung in vitro auf (Masterarbeit Thiesen A.M., 2012), doch die zugrundeliegenden epigenetischen Mechanismen sind bisher weitgehend unbekannt. Um die epigenetischen Veränderungen während der Chondrozytendifferenzierung zu untersuchen wurden proliferierende- und hypertrophe Chondrozyten mittels FACS (fluorescent activated cell sorting) aus den Skelettanlagen transgener Mäuse isoliert. Dazu wurden transgene Mäuse verwendet, die Yellow fluorescent protein unter Zelltyp-spezifischen Promotoren exprimierten. Ein ChIP-seq (Chromatin Immunopräzipitation mit anschließender Sequenzierung) Protokoll für geringe Zellzahlen wurde etabliert und das Chromatin sequenziert. Zur systematischen Analyse der Histonmodifikationen wurden sowohl aktivierende- als auch reprimierende Histonmodifikationen untersucht. Als Marker für transkriptionell-aktive Gene wurde die Kombination aus den vier aktivierenden Histonmodifikationen H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac und H3K36me3 verwendet, für bivalente Gene H3K4me3 und H3K27me3, für reprimierte Gene H3K9me3 und H3K27me3 und zur Enhancer Detektion H3K9ac und H3K27ac (Wang et al., 2008). Die biologischen Replikate von proliferierenden- und hypertrophen Chondrozyten wiesen eine hohe Korrelation sowohl auf Read- als auch auf Gen-Ebene auf. Die Anzahl der Peaks und der damit detektierten Gene war für die aktivierenden Histonmodifikationen H3K4me3, H3K9ac und H3K36me3 in beiden Zelltypen nahezu identisch. In hypertrophen Chondrozyten war die Anzahl für die reprimierenden Histonmodifikationen stark und für H3K27ac leicht erhöht, was auf eine globale Zunahme der Histonacetylierung und –Trimethylierung während der Differenzierung hindeutet. Um epigenetische Veränderungen im Verlauf der Differenzierung besser beurteilen zu können, wurde eine ChIP-Sequenzierung von undifferenzierten embryonalen Stammzellen (ES) angefertigt und mit den Profilen der zwei Chondrozytenpopulationen verglichen. Die drei Zellpopulationen zeigten zum einen, die erwarteten Histonmodifikations-Profile für Gene, deren Expression bekannt ist und zum anderen, dass die vier aktivierenden Histonmodifikationen zur Identifizierung von exprimierten Genen genutzt werden können. Der Vergleich aller transkriptionell-aktiven Gene von proliferierenden und hypertrophen Chondrozyten, gemessen am simultanen Auftreten aller vier aktivierenden Histonmodifikationen zeigte eine signifikante Steigerung von Chondrozyten-spezifischen Gen Ontologie (GO)-Terms und Signalwegen in proliferierenden Chondrozyten, während in den hypertrophen Zellen Apoptose-Terms und die Zellzyklus Inhibitoren gefunden wurden. Der Vergleich von Genen, die in proliferierenden, aber nicht in hypertrophen Chondrozyten aktiv sind zeigte, dass die Trimethylierung von H3K27 zur Repression von vorher aktiven Genen dient. Außerdem zeigte eine genaue Analyse der aktivierenden Markierungen, dass die Abschaltung der Expression immer mit der Methylierung von H3K27 beginnt worauf dann die aktivierenden Markierungen sukzessiv abgebaut werden. Für die Aktivierung von Genen wurden zwei mögliche Mechanismen gefunden. Entweder wurden nur aktivierende Marker oder H3K4me3 in Verbindung mit dem reprimierenden H3K27me3 angereichert, womit die Gensequenz zur Transkription geprimt wird und im Folgenden alle anderen aktivierenden Histonmodifikationen akkumulierten. Die Analyse der H3K27ac-Markierung detektierte eine größere Anzahl an Enhancern in hypertrophen- als in proliferierenden Chondrozyten und ES-Zellen. Dabei waren in hypertrophen Chondrozyten mehr Enhancer als aktive Gene vorhanden. Dies lässt darauf schließen, dass mehrere Enhancer zur Aktivierung eines Genes benötigt werden. Die Lokalisation der Enhancer offenbarte eine Abnahme der Distanz zwischen Enhancer und Gen im Verlauf der Differenzierung. In proliferierenden- und hypertrophen Chondrozyten wurden nur 202 identische Enhancerregionen detektiert, wobei aber für 899 Gene in beiden Populationen ein Enhancer identifiziert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die beiden Chondrozyten-Populationen unterschiedliche Enhancerregionen für die Regulation eines Gens nutzen. Interessanterweise zeigte die Korrelation von Enhancern und exprimierten Genen, dass Enhancer bereits in proliferierenden Chondrozyten markiert werden, obwohl das korrespondierende Gen erst in hypertrophen Chondrozyten aktiviert wird. Zudem trugen die Enhancer auch nach Abschaltung der Gene die H3K27ac-Markierung. Die gleichzeitige Trimethylierungen von H3K4 und H3K27 (bivalente Markierung) wurden bereits für Gene in ES-Zellen beschrieben, die zur Expression geprimt sind. Hier konnte gezeigt werden, dass die Expression von hypertrophen Chondrozyten-spezifischen Genen ebenfalls durch eine bivalente Markierung in proliferierenden Chondrozyten vorbereitet wird. Interessanterweise wurde ein erhöhtes Auftreten der bivalenten Markierung insbesondere in hypertrophen Chondrozyten detektiert. Neben der bekannten Feinregulation durch die bivalente Markierung wurde ein Langzeit-Mechanismus entdeckt, mit dem Entwicklungs-spezifische Gene dauerhaft reprimiert werden. In ES-Zellen und proliferierenden Chondrozyten diente H3K27me3 hauptsächlich der Regulation von bivalenten Genen, jedoch nahm die Anzahl an reprimierten Genen, unabhängig vom bivalenten Marker H3K4me3, im Verlauf der hypertrophen Differenzierung zu, was auf eine neue Funktion von H3K27me3 hinweist. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit nicht nur die generelle Änderung der Histonmodifikationen während der Chondrozytendifferenzierung nachgewiesen werden, sondern es wurden grundlegende Histonmodifikations-Muster der Transkriptionsregulation entdeckt, die eine fundierte Grundlage für die weitere Forschung bilden.