Mikrobieller Abbau von Naphthalin unter anaeroben Bedingungen

In the anaerobic degradation pathway of naphthalene, initial activation of this unsubstituted bicyclic aromatic hydrocarbon is achieved via a naphthalene carboxylase (Mouttaki et al., 2012). Dearomatisation is then realised through aryl-CoA reductases (Eberlein et al., 2013a) which require a prior activation of the substrate by the formation of a CoA-thioester. The 2-naphthoate:CoA ligase identified in this work (chapter 2) therefore serves as a link for the previously described metabolic steps. The substrate specificity of this enzyme was characterised in cell free extracts of the sulphate-reducing naphthalene degraders N47 and NaphS2. In addition, the enzyme from NaphS2 could also be heterologously produced in E. coli. Further studies will focus on the characterisation of the pure ligase enzymes. An antecedent study showed that the intermediate 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoyl-CoA (THNCoA) is further reduced to a hexahydro-2-naphthoyl-CoA by an ATP-dependent and oxygen-sensitive reductase with NADH as electron donor (Eberlein et al., 2013a). However, only a partial conversion of the substrate could be achieved in the referred study and the conformation of the product remained unclear. This work provides evidence that 2-oxoglutarate is the natural electron donor of the THNCoA reducing system and that most likely 4,4a,5,6,7,8-hexahydro-2-naphthoyl-CoA is the product of this reduction (chapter 4). This implies a downstream pathway analogous to the benzoyl-CoA pathway described for T aromatica (Harwood et al., 1999) with cleavage of the first ring occurring between C2 and C3. Through β-oxidation-like reactions, one side-chain of the cleavage-product is then shortened by one acetyl-CoA unit resulting in cis-2-(carboxymethy)cyclohexane-1-carboxyl-CoA. The free acid of this compound was also identified as a metabolite of the naphthalene-degrading enrichment culture N47 in prior metabolomic analyses (Annweiler et al., 2002). The enzymes responsible for these metabolic steps are encoded by the thn-operon which was identified in this work (chapter 3). This operon contains genes coding for the four subunits of the THNCoA reductase as well as for putative hydratases, hydrolases, dehydrogenases and thiolases. Most of these enzymes could be heterologously produced in E. coli and in some cases the postulated enzyme function could also be verified via enzyme tests with general substrate analogues. As elucidated in chapter 5, the further downstream pathway proceeds through cis-2-(2-carboxycyclohexyl)acetyl-CoA. Like the aforementioned cis-2-(carboxymethy)-cyclohexane-1-carboxyl-CoA, this compound is also a CoA-ester derivative of cis-2-(car-boxymethy)cyclohexane-1-carboxylic acid but with the CoA-thioester attached at the other carboxyl group. The putative CoA-transferase ThnP encoded by the thn-operon might catalyse the required intramolecular transfer of the CoA-thioester to form cis-2-(2-carboxycyclohexyl)acetyl-CoA. Subsequently, the latter is converted by an acyl-CoA dehydrogenase and an enoyl-CoA hydratase yielding cis-2-(1-hydroxy-2-carboxy-cyclohexyl)acetyl-CoA, which might be the substrate for a novel ring-opening lyase. This lyase reaction was deduced from sequence homologies of two enzymes encoded by the thn-operon (ThnQ and ThnS, presumably forming an enzyme complex ThnQS) to another proposed lyase. The lyase would yield 3-oxoazeloyl-CoA which implies a link to central metabolism via pimeloyl-CoA and glutaryl-CoA. The conversion of the latter two metabolites in cell free extracts of N47 and NaphS2 was demonstrated in this work. This is the first time that a complete metabolic route towards central metabolism was delineated for the anaerobic degradation of naphthalene. Regarding the involved enzymes, some discrepancies between the benzoyl-CoA and the 2-naphthoyl-CoA degradation pathway were observed: Although it was postulated that strict anaerobic benzoate degraders generally employ an ATP-independent benzoyl-CoA reductase (Loeffler et al., 2011), it could be shown that the reduction of the benzoyl-CoA analogue THNCoA in sulphate-reducing naphthalene degraders is catalysed by an ATP-dependant enzyme. Furthermore, no enzyme similar to the crotonase-like 6-oxo-cyclohex-1-ene-1-carboxyl-CoA hydratase/hydrolase that usually occurs in the benzoyl-CoA pathway proceeding via the cyclic diene intermediate cyclohexadienecarboxyl-CoA (Kuntze et al., 2008) is present in N47 or NaphS2. The cyclic diene metabolite β’-hydroxy-β-oxodecahydro-2-naphthoyl-CoA identified in the downstream pathway of anaerobic naphthalene degradation (see chapter 4) might be converted by the concerted action of two separate enzymes, a hydratase and hydrolase, leading to the cleavage of the first ring. In general, the phylogeny of the crotonase-like enzymes encoded by the thn-operon indicates reactions on intermediates derived from the cyclic monoene octahydro-2-naphthoyl-CoA, but the metabolites detected downstream of the THNCoA reductase product clearly prove that the β-oxidation-like sequence starts from hexahydro-2-naphthoyl-CoA. Therefore, this sequence seems to be catalysed by unusual enzymes that might be specific for anaerobic of PAH degraders. Furthermore, the putative ring-opening lyase ThnQS, which is assumed to mediate cleavage of the second ring, would represent a completely novel enzyme once its function is proven. The respective genes (thnQ and thnS) as well as the ones coding for the aforementioned unusual crotonase-like enzymes might therefore be suitable as gene markers for the detection of anaerobic bacteria capable of degrading naphthalene or other PAHs. Comparable lyase reactions might be a common principle of degradation pathways of polycyclic compounds since they offer a convenient solution for cleaving ring systems with more than one side-chain or for the linearisation of branched intermediates. Either of these types of metabolites inevitably occurs during the degradation of polycyclic compounds. Thus it will be interesting to see if enzymes similar to ThnQS can also be identified in other PAH-degrading cultures in the future. In this work, most of the metabolic steps in the downstream pathway of anaerobic naphthalene degradation starting from THNCoA were measured in cell free extracts of sulphate-reducing naphthalene degraders and furthermore the thn-operon coding for the enzymes involved in the downstream pathway was identified. The objective of further studies should be the linkage of the observed reactions in cell free extracts to the catalytic function of specific proteins. Up to now, this attempt was hampered by the fact that the conformation of the hexahydro-2-naphthoyl-CoA isomer produced by the THNCoA reductase could not be identified and the conformations of downstream metabolites were likewise unknown. Therefore, the heterologously produced enzymes could not be assayed towards their native substrates yet. The results obtained in this work revealed that the reductase product is most likely 4,4a,5,6,7,8-hexahydro-2-naphthoyl-CoA, albeit this needs to be verified by NMR-analysis. This identification enables a targeted chemical synthesis of the naturally occurring isomer. However, the appropriate activity of the 2-naphthoate:CoA ligase from N47 towards its substrate analogue 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoate (see chapter 2) might enable a more convenient enzymatic synthesis via a coupled system consisting of a CoA-ligase reaction on 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoate and a subsequent THNCoA reductase reaction in cell free extracts. When running the reductase assay with 2-oxo-glutarate as electron donor, a complete conversion of THNCoA can be achieved and downstream processes can by inhibited by amending the assay mixture with an excess of NADH (see chapter 4). This strategy has the advantage that it should yield only the naturally occurring isomer of hexahydro-2-naphthoyl-CoA. Starting from this hexahydro-2-naphthoyl-CoA isomer, a stepwise conversion through candidate enzymes encoded by the thn-operon should be possible, whereas the product of one conversion would serve as substrate for the subsequent enzyme. Finally, these coupled enzymatic conversions should result in a reproduction of the metabolic steps observed in assays with cell free extracts and to an assignment of a metabolic function to all enzymes encoded by the thn-operon.

Die initiale Aktivierung des unsubstituierten bizyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs Naphthalin geschieht im anaeroben Abbauweg durch eine Naphthalin Carboxylase. Die De-aromatisierung wird danach durch mehrere Aryl-CoA Reduktasen realisiert, welche nur mit Substraten reagieren können die zuvor Bildung eines einen Coenzym A Thioester aktiviert wurden. In dieser Arbeit wurde die 2-Naphthoat:CoA Ligase identifiziert, welche die beiden zuvor beschrieben metabolischen Schritte miteinander verknüpft. Die Substrat-Spezifität dieses Enzyms wurde in zellfreien Extrakten der beiden Sulfat-reduzierenden Naphthalin-abbauenden Bakterienstämme N47 und NaphS2 charakterisiert. Zudem wurde das Enzym aus NaphS2 heterolog in Escherichia coli produziert. Dies ermöglicht die biochemische Charakterisierung des isolierten Ligase-Enzyms in zukünftigen Arbeiten. Vorhergehende Untersuchungen zeigten, dass das Zwischenprodukt der de-aromati-sierenden Reaktionen, 5,6,7,8-Tetrahydro-2-naphthoyl-CoA (THNCoA), durch eine ATP-abhängige und Sauerstoff-sensitive Reduktase mit NADH als Elektronendonor weiter reduziert wird zu einem Hexahydro-2-naphthoyl-CoA. Allerdings wurde in diesen Arbeiten nur eine teilweise Umsetzung des Substrats erreicht und die genaue Konformation des Produkts konnte nicht ermittelt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass 2-Oxoglutarat der natürliche Elektronendonor des THNCoA reduzierenden Systems ist und dass das Produkt sehr wahrscheinlich 4,4a,5,6,7,8-Hexahydro-2-naphthoyl-CoA ist. Dies impliziert einen weiteren Abbauweg analog zum anaeroben Benzoyl-CoA Weg, wie er für Thauera aromatica beschrieben wurde. Die erste Ringöffnung würde in diesem Weg zwischen C2 und C3 stattfinden. Eine Seitenkette würde dann durch β-Oxidations ähnliche Reaktionen um eine Acetyl-CoA Einheit verkürzt, wodurch sich cis-2-(Carboxymethyl)cyclohexan-1-carboxyl-CoA ergibt. Die freie Säure dieses Metaboliten wurde bereits durch frühere Metabolitanalysen in der Naphthalin-abbauenden Anreicherungskultur N47 identifiziert. Die an diesen metabolischen Schritten beteiligten Enzyme werden von Genen aus dem thn-Operon codiert, welches in dieser Arbeit identifiziert wurde. Bei diesen Enzymen handelt es sich einerseits um die vier Untereinheiten der zuvor erwähnten THNCoA Reduktase sowie andererseits beispielsweise um mutmaßliche Hydratasen, Hydrolasen, Dehydrogenasen und Thiolasen. Die meisten dieser Enzyme konnten heterolog in E. coli produziert werden und die postulierten Enzymfunktionen wurden teilweise durch Enzymassays mit allgemeinen Substrat-Analoga nachgewiesen. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, gehen die weiteren metabolischen Schritte von cis-2-(2-Carboxycyclohexyl)acetyl-CoA aus. Ebenso wie der oben erwähnte Metabolit cis-2-(carboxymethyl)cyclohexane-1-carboxyl-CoA ist auch diese Verbindung ein CoA-Ester Derivat der cis-2-(Carboxymethyl)cyclohexan-1-carboxyl Säure, wobei der CoA-Ester in diesem Fall an der anderen Carboxyl-Gruppe sitzt. Die mutmaßliche CoA-Transferase ThnP, welche von einem Gen des thn-Operons codiert wird, könnte den intramolekularen CoA-Transfer katalysieren, welcher für die Bildung von cis-2-(2-Carbox-ycyclohexyl)acetyl-CoA benötigt wird. Dieser Metabolit wird anschließend durch eine Acyl-CoA Dehydrogenase und eine Enoyl-CoA Hydratase zu cis-2-(1-Hydroxy-2-carboxy-cyclohexyl)acetyl-CoA umgesetzt, welches dann möglicherweise als Substrat für eine neuartige ringöffnende Lyase dient. Die Möglichkeit einer solchen Lyase-Reaktion wurde abgeleitet aus Sequenzähnlichkeiten von zwei im thn-Operon codierten Enzymen (ThnQ und ThnS, die vermutlich einen Enzymkomplex ThnQS bilden) zu einer anderen postulierten Lyase. Das Produkt dieser Layse-Reaktion wäre 3-Oxoazeloyl-CoA, wodurch eine Verknüpfung zu zentralen Stoffwechselintermediaten über Pimeloyl-CoA und Glutaryl-CoA impliziert wird. Die Umsetzung dieser beiden Metabolite in zellfreien Extrakten von N47 und NaphS2 konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. Damit wurde erstmals ein möglicher Stoffwechselweg für den anaeroben Abbau von Naphthalin bis hin zum zentralen Metabolismus aufgezeigt. Bei Betrachtung der am anaeroben Naphthalin-Abbauweg beteiligten Enzyme fielen Abwei-chungen zu den Enzymen des Benzoyl-CoA Wegs auf: Obwohl zuvor postuliert wurde, dass strikt anaerobe Benzoat-Abbauer generell eine ATP-unabhängige Benzoyl-CoA Reduktase aufweisen, konnte gezeigt werden, dass die Reduktion des Benzoyl-CoA Analogons THNCoA in Sulfat-reduzierende Naphthalin-Abbauern von einem ATP-abhängigen Enzym katalysiert wird. Des Weiteren wurde weder in N47 noch in NaphS2 ein homologes Enzym zur 6-Oxo-cyclohex-1-en-1-carboxyl-CoA Hydratase/Hydrolase gefunden, welche üblicherweise in Benzoyl-CoA Abbauwegen über das zyklische Dien-Intermediat Cyclohexadiencarboxyl-CoA vorkommen. Dennoch wurde auch im anaeroben Naphthalin-Abbauweg ein zyklisches Dien-Intermediat, β’-Hydroxy-β-oxodecahydro-2-naphthoyl-CoA, identifiziert. Dieses wird möglicherweise nacheinander von zwei separaten Crotonase-ähnlichen Enzymen, einer Hydratase und einer Hydrolase, umgesetzt, wodurch der erste Ring geöffnet wird. Generell deutete die Phylogenie der innerhalb des thn-Operons codierten Crotonase-ähnlichen Enzyme eher auf einen Abbauweg über das zyklische Monoen-Intermediat Octahydro-2-naphthoyl-CoA hin, aber die im Anschluss an das THNCoA Reduktase Produkt auftretenden Metabolite bewiesen eindeutig, dass die β-Oxidations ähnliche Sequenz des weiteren Abbauwegs von Hexahydro-2-naphthoyl-CoA ausgeht. Diese Sequenz scheint daher von ungewöhnlichen Enzymen katalysiert zu werden, welche charakteristisch für anaerobe Mikroorganismen sein könnten, die polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs) abbauen. Auch die postulierte Ring-öffnende Lyase ThnQS würde ein komplett neuartiges Enzym dar-stellen, falls dieses tatsächlich wie vermutet die Öffnung des zweiten Rings ermöglicht. Die entsprechenden Gene (thnQ und thnS) sind ebenso wie die Gene für die zuvor beschriebenen ungewöhnlichen Crotonase-ähnlichen Enzyme aussichtsreiche Kandidaten für Gen-Marker, welche die Detektion von Bakterien mit der Fähigkeit zum anaeroben Abbau von Naphthalin oder anderen PAKs ermöglichen könnten. Ähnliche Lyase-Reaktionen könnten auch ein allgemeines Prinzip für den Abbau polyzyklischer Verbindungen darstellen, da sie eine einfach Möglichkeit für die Öffnung von Ringsystemen mit mehr als einer Seitenkette oder für die Linearisierung verzweigter Intermediate bieten. Eine dieser beiden Arten von Intermediaten tritt unausweichlich während des Abbaus polyzyklischer Verbindungen auf. Es wird daher interessant sein zu sehen, ob Enzyme mit Ähnlichkeit zu ThnQS in Zukunft auch in anderen PAK-abbauenden Kulturen identifiziert werden können.


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