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Entwicklung einer vierdimensionalen Trennmethode für die Analyse komplexer Proben

Stephan, Susanne

In dieser Arbeit wurde eine analytische Trennmethode in vier Dimensionen (2D-LC, IMS und MS) aufgebaut, die zusammen mit einer ebenfalls entwickelten Datenbank für CCS-Werte die non-target Analyse komplexer Proben ermöglicht. Dazu wurden Methoden zur Bestimmung von CCS mittels IM-qTOF-MS untersucht und auf ihre Reproduzierbarkeit hin überprüft. CCS-Werte unterschiedlicher Adduktionen von mehr als 500 Standardsubstanzen wurden anschließend gemessen und in eine Datenbanksoftware eingetragen. Zusätzlich wurden CCS-Werte von Lipiden unterschiedlicher Klassen aus einer komplexen Mischung ermittelt. Des Weiteren wurde anhand einiger Beispiele untersucht, inwieweit isobare Substanzen mittels IM-qTOF-MS getrennt und anhand ihrer CCS-Werte unterschieden werden können. Dabei wurde festgestellt, dass bei einigen Konstitutionsisomeren eine Trennung gut möglich ist, gerade bei kleineren Molekülen die Unterschiede in der räumlichen Struktur zum Teil aber nicht ausreichend sind, um eine genügend große Differenz der Driftzeiten im IMS zu erreichen. Es zeigte sich zudem, dass die Trennung von Isobaren auch vom betrachteten Adduktion abhängig ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Analysen verschiedener Realproben mit HPLC-IM-qTOF-MS durchgeführt. Dabei konnte am Beispiel von Zitronensaft gezeigt werden, dass coeluierende, isobare Substanzen in der IM-Dimension eine Auftrennung erfahren und dass bei Peaks mit gleichen exakten Massen die CCS-Werte zu einer sichereren Identifizierung beitragen. Somit können mehr Informationen gewonnen werden als mit herkömmlichen HPLC-MS Messungen. Anhand der Analyse von Orangensaftproben wurde die Anwendung der Hauptkomponentenanalyse auf die komplexen Datensätze gezeigt, die die Unterscheidung von Proben zwei verschiedener Gruppen ermöglicht. Der Nutzen der zuvor erstellten CCS Datenbank für die Identifizierung von Komponenten einer Probe konnte anhand eines Pflanzenextrakts aus Castanea sativa und zwei lipidhaltigen Realproben demonstriert werden. Darauf aufbauend wurde in dieser Arbeit eine zweidimensionale HPLC-Methode entwickelt (LC+LC), die an das vorhandene IM-qTOF-MS-System gekoppelt werden kann. Dabei konnte über eine lange Modulationszeit von vier Minuten erreicht werden, dass Analyten nicht oder höchstens einmal moduliert werden und dadurch eine visuelle Darstellung und Datenauswertung mit aktuell verfügbarer Software möglich ist. Die entwickelte vierdimensionale Methode (LC+LC-IM-qTOF-MS) wies eine gute Reproduzierbarkeit hinsichtlich Retentionszeiten und Peakflächenverhältnissen auf und erreichte eine Peakkapazität von über 8000. Anhand der Analyse einer Abwasserprobe konnte die hohe Trennleistung der Methode und die Anwendbarkeit der CCS Datenbank für die non-target-Analyse gezeigt werden. Dabei konnten, aufgrund der verbesserten Trennung nach der Analyse mit LC+LC-IM-qTOF-MS, deutlich mehr Substanzen identifiziert werden als in der gleichen Probe nach einer HPLC-IM-qTOF-MS Messung. Abschließend wurde eine GC-APCI-IM-qTOF-MS Kopplung realisiert und am Beispiel eines Pflanzenextrakts von Ginkgo biloba demonstriert, dass auch hier die IMS als zusätzliche Trenndimension in einer Analyse mehr Informationen über eine Probe liefern kann.

In the work presented here, an analytical separation method in four dimensions (2D-LC, IMS and MS) was developed, which allows, in combination with a database containing CCS-values established here as well, non-target analysis of complex samples. For this purpose, methods for the measurement of CCS with IM-qTOF-MS were determined and their reproducibility was checked. More than 500 standard substance have been measured and CCS of their different adduct ions were calculated and merged in a database software. Furthermore, CCS-values of lipids, including different classes, have been determined. The possibility of IM-qTOF-MS to separate isobaric structures and to differentiate between them according to their CCS was examined. It was found that some constitutional isomers can be separated properly, but that for some others, especially in smaller molecules, differences in their structure are too slight to obtain enough difference in ion mobility drift times. Additionally, it was shown that isobaric separation in IMS depends on the kind of adduct ion. The second part of this work is concerned with HPLC-IM-qTOF-MS analysis of real samples. Examples of lemon juice show the separation of coeluting isobaric compounds in the IM dimension and how CCS values can help to identify peaks with the same exact mass. Therefore, more information are gained compared to a conventional HPLC-MS measurement. After the analysis of orange juice samples, a principal component analysis for evaluation of complex data sets and differentiation of two sample groups was carried out. The CCS database established before can be used for identification of compounds in complex samples, which is shown for a plant extract from Castanea sativa and two samples containing lipids. Based on these results, a two-dimensional HPLC method (LC+LC) suitable for coupling to the IM-qTOF-MS system was developed. Using a long modulation time of four minutes, it could be achieved that analytes are not or only one time modulated. This enables data visualization and evaluation with currently available software. The four-dimensional separation method (LC+LC-IM-qTOF-MS) was shown to have good reproducibility regarding retention times and peak area ratios. A peak capacity of more than 8000 was obtained when an extract of Ginkgo biloba was analyzed. The analysis of a waste water sample revealed the high separation power of the method and the applicability of the CCS database for non-target analysis. Therein, due to the better separation, after LC+LC-IM-qTOF-MS analysis a significantly higher number of analytes was identified than in the same sample after a 1D-LC-IM-qTOF-MS measurement. Finally, a GC-APCI-IM-qTOF-MS coupling was realized. Exemplified through a Ginkgo biloba sample it was also demonstrated here, that IMS as an additional separation dimension can reveal additional information about a sample.

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Stephan, Susanne: Entwicklung einer vierdimensionalen Trennmethode für die Analyse komplexer Proben. 2016.

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