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Die Rolle endosomaler Toll-like Rezeptoren im Tumormikromilieu

Klein, Johanna Christina

Tumore bestehen aus malignen Zellen und dem Tumorstroma. Letzteres setzt sich aus nicht-hämatopoetischen Zellen und dem Immunzellinfiltrat zusammen und macht häufig einen Großteil der Tumormasse aus. Wechselwirkungen zwischen den Tumorzellen und dem Stroma beeinflussen die Biologie der beteiligten Zellen und die Pathophysiologie der Erkrankung. Toll-like Rezeptoren (TLRs) haben eine Schlüsselfunktion in der Aktivierung des Immunsystems. Die Aktivierung von TLRs kann anti-tumorale Effekte induzieren, die vor allem durch den Einsatz therapeutischer exogener Liganden hervorgerufen werden, während eine pro-tumorale Wirkung vorrangig für endogene Liganden beschrieben wurde. Um diese gegensätzlichen Befunde besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit die Rolle endosomaler TLRs auf den verschiedenen Kompartimenten der Tumormikroumgebung analysiert. Initiale Untersuchungen der vorliegenden Arbeit sollten in TLR3/7/9-/- Mäusen Aufschluss darüber geben, welche TLRs und nachfolgende Signalwege an der Tumorabstoßung beteiligt sind. Die Untersuchung von Einzel- und Doppel-TLR-Knockoutmäusen zeigte, dass nur durch das Fehlen aller drei endosomaler Rezeptoren eine effiziente Abstoßung eintrat. Die Beteiligung mehrere TLR-Signalwege wurde durch die Tumorabstoßung in den MyD88/Trif-/- Mäusen bestätigt. Interessanterweise entwickelten jedoch die meisten der TLR2/3/4/7/9-Knockoutmäuse einen soliden Tumor, was für einen entgegengesetzten Effekt der endosomalen TLRs (3, 7, 9) und der Oberflächenrezeptoren TLR2 und TLR4 spricht. Um den relativen Beitrag des nicht-hämatopoetischen Stromas und des Immunzellinfiltrats an der Tumorregression zu untersuchen, wurden Knochenmarkchimären eingesetzt. Deren Untersuchung zeigte, dass beide Kompartimente an der Abstoßungsreaktion beteiligt waren. Dies wurde durch den adoptiven Transfer markierter Milzzellen bestätigt, da es nur zur Immunzellrekrutierung in den Tumor kam, wenn auf beiden Kompartimenten endosomale TLRs fehlten. Anschließende Untersuchungen des nicht-hämatopoetischen Stromas zeigten deutliche Unterschiede in der Ausbildung von Tumorgefäßen. Während die Tumore der WT Mäuse von einem feinen Kapillarsystem durchzogen wurden, bildeten sich in den Tumoren der TLR3/7/9-/- Mäuse eine geringere Anzahl heterogener Gefäße, die einen deutlich größeren Durchmesser aufwiesen, von Perizyten ummantelt waren und nicht alle Bereiche des Tumors versorgten. Im Kompartiment des hämatopoetischen Stromas konnte gezeigt werden, dass eine lokale anti-tumorale Immunreaktion für die Tumorabstoßung verantwortlich war. Während systemisch keine Unterschiede in der Aktivierung von dendritischen Zellen und T-Zellen festgestellt werden konnten, waren die Tumore der TLR3/7/9-/- Mäuse sehr stark mit Zellen des angeborenen und des adaptiven Immunsystems infiltriert. Durch Depletionsversuche konnte demonstriert werden, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen für die Abstoßung verantwortlich waren. Dies wurde durch den Befund bestätigt, dass TLR3/7/9-/- Mäuse nach einmaliger Injektion der Tumorzellen eine Immunität gegen diese Zellen ausbildeten, sodass es zu keiner erneuten Ausbildung eines Tumors kommen konnte. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass durch das Fehlen der endosomalen Toll-like Rezeptoren TLR3, TLR7 und TLR9 Veränderungen in der Tumormikroumgebung auftreten, die zu eine T-Zell-abhängigen Tumorabstoßung führten. Daraus lässt sich ein pro-tumoraler Effekt dieser Rezeptoren in der WT-Situation bzw. die Ermöglichung einer anti-tumoralen Immunreaktion in den TLR3/7/9-/- Mäusen ableiten. Dieser Befund ist von besonderer Bedeutung, da endosomale TLRs bislang vorwiegend mit exogener therapeutischer Stimulation in Verbindung gebracht wurden und die Stimulation durch endogene Liganden kaum untersucht ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass, unabhängig von therapeutischer Intervention, die endosomale TLR-Expression auf den hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen das Tumorwachstum beeinflussen kann. Die TLR-Aktivierung durch bislang nicht identifizierte endogene Liganden könnte zu einer pro-tumoralen Stimulation der Tumorzellen führen. Daher könnte die Inhibierung endosomaler TLRs eine neue Möglichkeit der therapeutischen Intervention bei bestimmten Tumorerkrankungen darstellen.

Tumors consist of malignant cells and the tumor stroma, which is composed of non-hematopoietic cells and the infiltrating immune cells. Often the stroma represents the major fraction of the whole tumor mass. The interaction between tumor and stromal cells influences the biology of the involved cells and the pathophysiology of the disease. Toll-like receptors (TLRs) are known as key players in immune activation. The activation of TLRs can induce anti-tumor effects, which are mostly generated by the use of therapeutic exogenous ligands, while pro-tumor effects are primarily described for endogenous ligands. To better understand these contrary indications, the impact of endosomal TLR expression on different compartments of the tumor microenvironment was analyzed in this thesis. Firstly the aim was to investigate which TLRs and subsequent pathways are involved in the tumor regression in the TLR3/7/9-/- mice. Tumor growth analysis in single and double TLR knockout mice showed that depletion of all three TLRs is necessary to induce tumor rejection. The involvement of several TLR pathways was confirmed by tumor rejection in MyD88/Trif-/- mice. Surprisingly, the majority of TLR2/3/4/7/9-/- mice developed a solid tumor, revealing a converse function of endosomal TLRs (3, 7, 9) and TLR2/4 located on the cell surface. To identify the relative contribution of the non-hematopoietic stromal cells and the infiltrating immune cells to tumor regression, bone marrow chimeras were generated. The investigation of these chimeras demonstrated the involvement of both compartments in the process of tumor rejection. This was confirmed by the adaptive transfer of labeled splenocytes and it was found that only if both compartments were deficient for endosomal TLRs then immune cells would be recruited to the tumor. Further investigation of the non-hematopoietic compartment revealed clear differences in the blood vessel development. While in WT mice, tumors were supplied by a fine capillary network, TLR3/7/9-/- mice developed a reduced number of tumor vessels which were characterized by a heterogeneous structure. TLR-deficient vessels showed an increased diameter and coverage by pericytes compared to tumor vessels of WT mice. Investigation of the hematopoietic compartment indicates a local anti-tumor response of the immune system. While no systemic activation of dendritic cells or T cells could be determined, tumors of TLR mice were highly infiltrated by innate and adaptive immune cells. Depletion of CD4+ or CD8+ T cells in vivo demonstrated that both cell types are necessary for tumor rejection. This was verified by the observation, that TLR3/7/9-/- tumor regressor mice were protected against a secondary challenge by the same tumor cell line. In summary, the experiments of this thesis showed for the first time that depletion of endosomal TLR3, TLR7 and TLR9 induces modification of the tumor microenvironment resulting in a T cell dependent tumor rejection. The data suggest a tumor promoting effect in the WT situation or alternatively the enabling of previously inactive anti-tumor mechanisms in TLR3/7/9-/- mice. These findings are of relevance as previously endosomal TLRs were mainly associated with exogenous therapeutic TLR stimulation while the relevance of endogenous signaling via these TLRs is largely unknown. This study now shows an effect of endosomal TLR expression by non-hematopoietic and hematopoietic stroma cells on tumor growth in the absence of therapeutic intervention. TLR activation, by still elusive ligands, in different compartments of the tumor/stroma entity by endogenous ligands could promote tumor growth. Thus inhibition of endosomal TLRs could lead to new therapeutic options in solid tumors.

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Klein, Johanna Christina: Die Rolle endosomaler Toll-like Rezeptoren im Tumormikromilieu. 2018.

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