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Studien zu der thaumarchaealen Prolyl-Isomerase NmPin aus Nitrosopumilus maritimus

Hoppstock, Lukas LSF

Peptidyl-Prolyl-Bindungen (Xaa-Pro) nehmen eine Sonderstellung innerhalb von Peptiden und Proteinen ein, da sie im Gegensatz zu nicht-prolinhaltigen Peptidindungen stabile cis-Isomere ausbilden können. Cis-ständige Xaa-Pro-Bindungen nehmen je nach Position innerhalb eines Proteins großen Einfluss auf dessen dreidimensionale Struktur und Funktion. Enzyme, welche die Rotation zwischen cis- und trans-Isomeren katalysieren, werden Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) genannt und sind ubiquitär in allen Domänen des Lebens zu finden. In der Zelle erfüllen PPIasen eine wichtige Rolle bei der Faltung und Regulation einer Vielzahl von Proteinen. In dieser Arbeit konnte erstmals die endogene Expression und detaillierte Charakterisierung eines archaealen Parvulins gezeigt werden. NmPin aus dem marinen, chemolithoautotrophen Thaumarchaeon Nitrosopumilus maritimus ist eine kleine single domain PPIase vom Parvulintyp (sdPar), welche in einem Protease-gekoppelten Aktivitätsassay Isomeraseaktivität gegenüber einer Reihe von unphosphorylierten, peptidischen Substraten zeigte. Mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten und Mutagenesestudien konnte das aktive Zentrum und einzelne für die Katalyse benötigte Reste (D42, S82) in der dreidimensionalen Struktur von NmPin lokalisiert werden. Eine detaillierte Untersuchung der Ligandenbindung zeigte zudem die Beteiligung eines Netzwerks von oberflächennahen, hydrophoben, verzweigten Aminosäureseitenketten bei der Fixierung des Liganden in der Prolinbindetasche. Bei genauer Analyse der Proteinoberfläche von NmPin konnte eine positiv geladene, Lysin-reiche Fläche identifiziert werden, die laut in vitro-Sedimentationsstudien für die Bindung von NmPin an Lipidvesikel verantwortlich ist. Bereits der Austausch eines zentralen, innerhalb der Thaumarchaeota konservierten Lysins (K7) gegen ein Glutamat führte zu einem Verlust der Bindungsfähigkeit. In Kooperation mit der Universität Aberdeen konnten immunofluoreszenz- und transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von NmPin in N. maritimus-Zellen gemacht werden, welche die Bindung des Proteins von außen an die Zellmembran in vivo bestätigen. Diese Ergebnisse lassen eine Lokalisation der PPIase in einem pseudo-periplasmatischen Raum zwischen der Zellmembran und dem S-Layer vermuten. Potentielle zelluläre Substrate für NmPin stellen in diesen Raum sekretierte Proteine oder Proteine des S-Layers dar.

Peptidyl-prolyl-bonds (Xaa-Pro) are exceptional in peptides and proteins due to their ability to form stable cis-isomers in contrast to all other non-proline peptide bonds. Relative to their position in a protein cis-isomeric Xaa-Pro bonds have a strong impact on the three dimensional structure and function of the protein. Enzymes which catalyse the rotation between cis- and trans-isomers are called peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerases (PPIases) and are ubiquitously found in all domains of life. In the cell PPIases play a crucial role in protein folding and protein regulating processes. This study is the first description of an endogenously expressed and in detail characterized archaeal Parvulin. NmPin from the marine, chemolithoautotrophic thaumarchaeon Nitrosopumilus maritimus is a small parvulin-type single domain PPIase (sdPar) which showed isomerase activity against a subset of unphosphorylated peptidic substrates in a protease-coupled activity assay. By using NMR titration experiments and mutagenesis studies the active site as well as single residues essential for catalysis (D42, S82) were identified in the three dimensional structure of NmPin. In addition a more detailed investigation of the ligand binding mechanism showed the participation of a network of surface exposed, hydrophobic, branched residue sidechains in ligand fixation inside the proline binding pocket. A thorough topological analysis revealed a positively charged, lysine-rich patch on the protein surface which targets NmPin to lipid vesicles in vitro. The exchange of a single central lysine (K7), which is conserved in thaumarchaeotes, against a glutamate already leads to a loss of the binding ability. In cooperation with the University of Aberdeen immunofluorescence- and transmission electron microscopy of NmPin in N. maritimus cells was done, that confirms that the protein is attached to the outer cell membrane in vivo. These results point towards a PPIase located in a pseudo-perisplamatic space between the cell membrane and the S-Layer. Hence potential cellular substrates for NmPin are proteins secreted into this space or proteins of the S-Layer.

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Hoppstock, Lukas: Studien zu der thaumarchaealen Prolyl-Isomerase NmPin aus Nitrosopumilus maritimus. 2016.

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