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Regulation and mitotic functions of the PP1 interactors SDS22 and inhibitor-3

Seiler, Jonas

Um Aneuploidie zu verhindern, müssen während der Mitose die Schwesterchromatiden der duplizierten Chromosomen korrekt auf beide Tochterzellen verteilt werden. Um dies zu gewährleisten, muss es zur Anbindung der Kinetochore der beiden Schwesterchromatiden an Spindelmikrotubuli kommen, die von entgegengesetzten Polen der mitotischen Spindel ausgehen. Diese bipolare Anbindung der Schwesterkinetochore wird durch eine dynamische Phosphorylierung von Kinetochorproteinen ermöglicht und reguliert. Zentrale Regulatoren dieses Prozesses sind die mitotische Kinase Aurora B und die entgegenwirkende Phosphatase PP1. Es wurde bereits gezeigt, dass SDS22, ein Interaktionspartner der Phosphatase PP1, für die volle Aktivität von Kinetochor-gebundenem PP1 vonnöten ist und somit als positiver Regulator der Phosphatase fungiert. Die genaue Lokalisation und Funktionsweise von SDS22 ist allerdings nicht geklärt, da hierzu kontroverse Ergebnisse veröffentlicht wurden. Es ist bekannt, dass SDS22 einen ternären Komplex mit PP1 und Inhibitor-3 (I3) bilden kann. In Hefezellen wurde gezeigt, dass Ypi1/I3 eine Rolle für die der Kinase Ipl1/Aurora entgegenwirkende Aktivität von PP1 spielt. Die Funktion von I3 in der Mitose in Säugerzellen ist allerdings bislang nicht untersucht worden. Ergebnisse aus Hefestudien zeigen darüber hinaus, dass auch die AAA ATPase Cdc48/p97 mit ihrem Kofaktor Shp1 eine Rolle als positiver Regulator von PP1 spielt und deuten darauf hin, dass Cdc48/p97-Shp1 auf den ternären SDS22-PP1-Ypi1/I3-Komplex einwirkt. Ziel dieser Studie war es, die Funktion von SDS22 am Kinetochor aufzuklären und die Rolle von I3 in der Mitose in Säugerzellen herauszufinden. Zudem wollten wir die Interaktion von p97 mit dem SDS22-PP1-I3-Komplex in Säugerzellen untersuchen. Unsere Ergebnisse lassen mindestens drei wichtige Schlussfolgerungen zu. Zum ersten zeigen unsere Daten, dass die Funktion von SDS22 in der Regulation von PP1 am Kinetochor komplex ist. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass SDS22 für die Aktivität von Kinetochor-gebundenem PP1 vonnöten ist. Im Gegensatz zu einer vorherigen Studie zeigen wir allerdings, dass SDS22 unter normalen Bedingungen nicht in quantitativen Mengen am Kinetochor zu finden ist und auch nicht als Rekrutierungsfaktor für PP1 zum Kinetochor fungiert. Obgleich SDS22 für die Funktion von PP1 am Kinetochor gebraucht wird, führt eine quantitative Bindung von SDS22 an das Kinetochor zur Inhibition der Dephosphorylierung von Aurora B an T232 durch PP1. Diese Ergebnisse lassen sich mit einem Modell erklären, in dem SDS22 eine Rolle als Chaperon oder Reifungsfaktor für PP1 spielt. In diesem Modell wird SDS22 für die Aktivierung von PP1 in Lösung gebraucht, welche der Dissoziation von SDS22 und der Bindung von aktiviertem PP1 an das Kinetochorprotein KNL1 vorausgeht. Zum zweiten klären wir die Rolle von I3 im Wechselspiel von PP1 und Aurora B auf. Eine Depletion von I3 führt zu einer quantitativen Bindung von SDS22 an PP1, welches an das Kinetochorprotein KNL1 gebunden ist. Dieser Effekt geht mit einer erhöhten Aktivität von Aurora B einher. Dies lässt sich dadurch erklären, dass I3 benötigt wird um SDS22-PP1 zu sequestrieren und in Lösung zu halten, wodurch es eine Assoziation von inaktivem, SDS22-gebundenem PP1 mit KNL1 am Kinetochor verhindert. Zusätzlich finden wir Hinweise darauf, dass I3 für eine Dissoziation von SDS22 von PP1 gebraucht werden könnte. Zum dritten zeigen wir, dass die Interaktion zwischen p97 und dem SDS22-PP1-I3-Komplex in humanen Zellen konserviert ist. Unsere Daten liefern wichtige erste Einblicke, wie p97, zusammen mit den Shp1 Orthologen p37, UBXD4 und p47, den SDS22-PP1-I3-Komplex regulieren könnte. Unsere Daten deuten darauf hin, dass p97 eine Rolle in der Regulation von PP1 spielen könnte, indem es SDS22 von dem ternären PP1-Komplex dissoziiert.

In order to achieve faithful chromosome segregation during mitosis and to avoid aneuploidy, the kinetochores of the two sister chromatids need to form attachments with microtubules emanating from opposite poles of the mitotic spindle. Bipolar attachment of sister kinetochores is regulated by dynamic phosphorylation of kinetochore proteins. Key regulators of this process are the mitotic kinase Aurora B and the counteracting phosphatase PP1. The PP1 interactor SDS22 has been shown to be involved in positively regulating kinetochore-associated PP1 in mammalian cells, however its exact localization and function has remained controversial. SDS22 is known to form a ternary complex with PP1 and inhibitor-3 (I3). While Ypi1/I3 is known to be involved in regulating PP1-mediated counteraction of Ipl1/Aurora kinase in yeast, the function of I3 in mammalian mitosis has thus far been unknown. Findings in yeast furthermore implicate the AAA ATPase Cdc48/p97 with its cofactor Shp1 in positively regulating PP1 and suggest that Cdc48/p97-Shp1 acts on the ternary SDS22-PP1-Ypi1/I3 complex. This study aimed at solving the function of SDS22 at the kinetochore and at elucidating the role of I3 in mammalian mitosis. In addition, we wanted to investigate the interaction of p97 with SDS22-PP1-I3 in mammalian cells. Our results allow us to draw at least three important conclusions. First, our data reveal a complex role of SDS22 in regulating kinetochore-associated PP1. We confirm that SDS22 is required for PP1 activity at the kinetochore. However, contrary to a previous report, we show that SDS22 does not quantitatively localize to kinetochores under normal conditions and does not function as a PP1 targeting factor to the kinetochore. Instead, while being required for PP1 activity at the kinetochore, SDS22 inhibits PP1-mediated dephosphorylation of Aurora B at T232 when bound to the kinetochore. This is consistent with a model in which SDS22 functions as a PP1 chaperone or maturation factor, mediating a PP1 activation step in solution that is followed by SDS22 dissociation and binding of activated PP1 to KNL1 at the kinetochore. Second, we elucidate the role of I3 in PP1-mediated balancing of Aurora B. Depletion of I3 leads to quantitative association of SDS22 with PP1 bound to KNL1 at the kinetochore, accompanied by increased Aurora B activity. This suggests that I3 is required for sequestering and keeping SDS22-PP1 in solution, thus preventing association of inactive SDS22-bound PP1 with KNL1 at the kinetochore. Additionally, we find indications that I3 is required for dissociation of SDS22 from PP1. Third, we show that the interaction between p97 and the SDS22-PP1-I3 complex is conserved in human cells. Our data provide important first insights on how p97, together with the Shp1 orthologs p37, UBXD4 and p47, may regulate the SDS22-PP1-I3 complex. Our results are consistent with a role of p97 in regulating PP1 by dissociating SDS22 from the ternary PP1 complex.

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Seiler, Jonas: Regulation and mitotic functions of the PP1 interactors SDS22 and inhibitor-3. 2018.

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