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Identifizierung und Charakterisierung neuer Protein-Interaktionspartner der humanen lncRNA PANDAR

Pospiech, Nicole

Die Expression der lncRNA PANDAR wird p53-abhängig über den CDKN1A Promotor induziert 1. Eine Überexpression der lncRNA PANDAR konnte bereits in einigen Tumorarten beobachtet werden, wobei diese erhöhte Expression mit einem invasiven Phänotyp und einer schlechten Überlebensprognose einherging 2,3. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass das endogene und durch Doxorubicin-induzierte PANDAR RNA Level je nach Zelllinie variiert. Darüber hinaus führte der PANDAR Knockdown in U2OS Osteosarkomzellen zu einer verringerten Zellviabilität, was auf eine Funktion der lncRNA PANDAR im Zellerhalt hindeutet. Ein Mechanismus für diesen Regulationsprozess ist die Decoy-Funktion der lncRNA PANDAR, wobei die Transkriptionsfaktor-Untereinheit NF-YA von den pro-apoptotischen Zielgenen entfernt wird 1. Die Analyse der direkten Bindung der lncRNA mit heterolog exprimierten und aufgereinigten NF-Y Fragmenten ergab eine Interaktion der PANDAR RNA mit der NF-YA Untereinheit und dem trimeren NF-Y Komplex. Dies deutet auf eine Bindung von PANDAR an eine Region von NF-YA hin, die nicht an der Formung des trimeren Komplexes beteiligt ist. Die Identifizierung des RNA-Bindemotivs von NF-YA ergab die genomisch annotierte Sequenzabfolge C(T/A)G(A/T). Jedoch zeigten die nachfolgend durchgeführten in vitro Mutationsstudien, dass das NF-YA-Fragment sowohl mit wildtypischen als auch mutierten PANDAR RNA Fragmenten Sequenz-unabhängig interagiert. Die Sequenzspezifität des im NF-YA PAR-CLIP ermittelten RNA-Bindemotivs könnte daher durch weitere Regulationsebenen, wie RNA-Sekundärstrukturen, posttranslationalen Proteinmodifikationen oder auch durch zusätzlich involvierte NF-YA Domänen des Volllängenproteins vermittelt werden. Für die Identifizierung weiterer PANDAR-bindende Proteine wurden gegen PANDAR gerichtete PNAs synthetisiert, getestet und im PNA-basierten SILAC-Experiment verwendet. Zusätzliche Validierungsprozesse der massenspektrometrisch analysierten Ergebnisse ergab eine Interaktion mit den unter anderem am Spleißprozess beteiligten Proteinen SAFA, hnRNPUL1, U2AF65 und PTBP1. Darüber hinaus wurde der Effekt der lncRNA PANDAR hinsichtlich der Transkriptvariante BCL-XS analysiert, wobei PTBP1 das alternative Spleißen dieser Variante initiiert 4. Die Überexpression der lncRNA PANDAR führte zu einer Reduktion der mRNA des pro-apoptotischen Bcl-XS. Hingegen konnte die gleichzeitige Überexpression von PTBP1 diese Reduktion wieder normalisieren. 1. Hung T, Wang Y, Lin MF, et al. Nat. Genet. 2011;43(7):621-9. doi:10.1038/ng.848. 2. Ma P, Xu T, Huang M, Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2016;78:172-176. doi:10.1016/j.biopha.2016.01.025. 3. Peng W, Fan H. Biomed. Pharmacother. 2015;72:113-118. doi:10.1016/j.biopha.2015.04.014. 4. Bielli P, Bordi M, Di Biasio V, Sette C. Nucleic Acids Res. 2014;42(19):12070-12081. doi:10.1093/nar/gku922.

The lncRNA PANDAR is transcribed from the CDKN1A promoter in a p53-dependent manner 1. Overexpression of lncRNA PANDAR has been observed in some tumor species, while the overexpression was correlated with an invasive phenotype and a reduced patient survival rate 2,3. In this thesis it has been shown that endogenous and DNA damage-induced PANDAR RNA expression varies depending on the cell line. Furthermore, the knockdown of PANDAR RNA within U2OS osteosarcoma cells revealed a reduced cell viability, indicating that PANDAR plays an important role for cell sustainability. One mechanism for this regulation process is the decoy function of lncRNA PANDAR, sequestering the transcription factor subunit NF-YA of its pro-apoptotic target genes 1. The analysis of direct binding of lncRNA PANDAR with purified NF-Y fragments revealed an interaction of PANDAR RNA with the NF-YA subunit and the NF-Y trimeric complex, pointing towards a binding of PANDAR to NF-YA in region that is not involved in subunits association. The analysis of RNA binding motif of NF-YA by PAR-CLIP identified the genomic annotated sequence C(T/A)G(A/T) as a possible RNA-binding motif. However, the following mutational studies revealed that NF-YA binds to wildtype and mutated PANDAR RNA fragments in a sequence-independent manner. It is possible that the sequence specificity of the NF-YA PAR-CLIP analyzed RNA binding motive could be mediated by other regulatory mechanisms like RNA secondary structure, posttranslational protein modifications or additional involved NF-YA domains of the full length protein. For identifying novel PANDAR binding proteins, PNAs directed against PANDAR RNA were synthesized, tested and used for a PNA-based SILAC experiment. Further validation steps of mass spectrometrically analyzed data revealed an interaction of PANDAR RNA with the splicing-involved proteins SAFA, hnRNPUL1, U2AF65 and PTBP1. Furthermore, the effect of lncRNA PANDAR concerning the transcript variant BCL-XS was analyzed, with PTBP1 being involved in the initiation of BCL-XS alternative splicing 4. The overexpression of lncRNA PANDAR reduced the mRNA level of pro-apoptotic BCL-XS, while the simultaneous overexpression of PTBP1 was able to rescue this effect by normalizing BCL-XS mRNA to the initial level. 1. Hung T, Wang Y, Lin MF, et al. Nat. Genet. 2011;43(7):621-9. doi:10.1038/ng.848. 2. Ma P, Xu T, Huang M, Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2016;78:172-176. doi:10.1016/j.biopha.2016.01.025. 3. Peng W, Fan H. Biomed. Pharmacother. 2015;72:113-118. doi:10.1016/j.biopha.2015.04.014. 4. Bielli P, Bordi M, Di Biasio V, Sette C. Nucleic Acids Res. 2014;42(19):12070-12081. doi:10.1093/nar/gku922.

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Pospiech, Nicole: Identifizierung und Charakterisierung neuer Protein-Interaktionspartner der humanen lncRNA PANDAR. 2017.

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