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Multidimensional high-performance liquid chromatography–gas chromatography (HPLC-GC) hyphenation techniques for food analysis in routine environments

Nestola, Marco

Routine monitoring of foodstuffs is an important instrument for consumer protection. Understandably, fast and robust analysis methods are necessary to cope with the modern nutritional habits of the fast-growing population. In contrast, the chemical complexity and variety of foodstuffs are challenges complicating the development of such analytical methods. Nevertheless, routine laboratories faced with thousands of samples per year need to be able to identify harmful substances and quality mismatches in a short time span. Chromatographic methods are omnipresent in the field of food science. They are used throughout the whole analytical process either for sample preparation or for analyte separation. However, online hyphenation of sample preparation with the separation and detection processes is so far rarely observed in routine environments. Hyphenation of liquid and gas chromatographic techniques (LC-GC), for example, provides an efficient and fast sample preparation online coupled to the chromatographic separation and detection method. Although this technique is known for almost thirty years, it is hardly used in routine laboratories. This might be related to technical difficulties in the past affecting robustness. Therefore, aim of this work was the development of selected analytical methods by means of LC-GC hyphenation with robust hardware solutions. Each development included a validation process enlightening the suitability of the analytical method in the scope of accuracy, robustness, and sample throughput for routine environments. The selected applications involve the analysis of unwanted contaminations in food (polycyclic aromatic hydrocarbons, mineral oil contaminations), the quality assurance of edible oils and fats, as well as the determination of the vitamin D content in certain foodstuffs for nutrition analysis. LC-GC hyphenation allowed direct injection of samples for applications typically involving time-consuming column chromatography cleanups. Methods requiring preceding sample preparation, such as saponification, derivatization, or liquid-liquid extraction, were successfully realized by coupling autosampler-based sample handling with subsequent robust LC-GC hyphenation. The determination of the sterol distribution and content in edible oils and fats was chosen as an example. The traditional method involves a multistage sample preparation, which requires tremendous amounts of manual and error-prone work. Collaborative trials regularly show insufficient precision among the participating laboratories. On the contrary, total automation of the sample preparation with subsequent LC-GC analysis offered a substantial increase of precision, robustness, and sample throughput. The here developed method allowed an average sample throughput of one sample per hour. The only manual step left was to weigh the sample into an autosampler vial, making this method amenable to the requirements of contract laboratories. Additionally, the identity of a previously unreported sterol specifically present in sunflower oils was enlightened by the advantages of the analytical HPLC cleanup and extension of the method with mass spectrometric (MS) detection for structure elucidation. The determination of the vitamin D content in multiple foodstuffs is another example for a successful implementation of an LC-GC method. While vitamin D is typically detected by liquid chromatographic methods, the use of online LC-GC-MS allowed the quantitation of vitamin D also in complex foodstuffs, such as cholesterol-lowering margarines, known to be challenging for established analysis methods. In the further course of this work, deficiencies of LC-GC hyphenation for the determination of aromatic hydrocarbons in a broad range of foodstuffs were examined. A single HPLC cleanup proved to be insufficient for a robust determination of the selected analytes, showing that LC-GC hyphenation has its limits as any other analytical tool. Increasing the dimensionality of the sample cleanup was necessary to overcome these deficiencies. The determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) became feasible by the development of an easy and quick generic sample preparation protocol and employment of a second HPLC cleanup stage. This two-dimensional heart-cut LC-GC-MS method offered high sample cleanup for complex foodstuffs such as edible oils/fats, teas, coffees, or chicken eggs. Additionally, comprehensive validation of the method was performed for extra virgin olive oils proving its precision, robustness, and trueness. Selective derivatization of interfering food matrix compounds was used for the determination of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in edible oils and fats. While HPLC cleanup was insufficient, alteration of the food matrix polarity in conjunction with LC-GC hyphenation provided an appropriate sample cleanup. Automation and optimization of the reaction conditions, however, was essential for a robust method. In a nutshell, this thesis shows that LC-GC hyphenation is comprehensively suited for the use in routine environments with a growing portfolio of applications. Extension of common LC-GC hyphenation with automated sample preparation techniques opened new possibilities for challenging applications as could be shown for the determination of sterols. Besides analytical suitability, however, standardization work by national authorities or responsible working groups is needed for a widespread distribution of LC-GC methods in routine laboratories.

Die Lebensmittelüberwachung ist ein wichtiges Instrument des Verbraucherschutzes. Die modernen Ernährungsgewohnheiten der stetig wachsenden Bevölkerung machen die Verwendung effizienter, schneller und robuster Analysemethoden notwendig. Im Gegensatz dazu stehen jedoch die Vielfalt und Komplexität vieler Lebensmittel, die eine schnelle Analytik oft erschweren. Gängige Analysetechniken umfassen neben dem eigentlichen Analyseprozess komplizierte und teils zeitaufwendige Probenvorbereitungen. Entsprechend optimierte Techniken sind daher notwendig, um diesen Anforderungen gerecht zu werden. Andernfalls wäre es für Auftragslabore, die mit mehreren Tausend Proben im Jahr konfrontiert sind, nicht möglich, gesundheitsschädliche Inhaltsstoffe oder Qualitätsdefizite eines Lebensmittels zeitnah aufzudecken. Chromatographische Trenntechniken finden zumeist Anwendung im gesamten Probenhandling, sei es bei der Probenvorbereitung oder im eigentlichen Trennprozess. Die Onlinekopplung beider Schritte ist jedoch bisher selten für Routineumgebungen beschrieben worden. Die Kopplung flüssigkeits- und gaschromatographischer Techniken (LC-GC) ermöglicht es beispielsweise, komplexe Analysemethoden effizient und robust zu automatisieren. Dabei wird die Probenvorbereitung online direkt an den anschließenden chromatographischen Trenn- und Detektionsprozess gekoppelt. Die HPLC übernimmt hier die Aufgabe einer analytischen Probenvorbereitung, während die GC als robuste Quantifizierungstechnik verwendet wird. Obwohl die Kopplungstechnik als solche bereits seit über 30 Jahren bekannt ist, wurde sie dennoch nie in großem Maßstab in Routineumgebungen eingeführt. Ein Grund dafür mag in den technischen Anforderungen und den daraus resultierenden Stabilitätsproblemen liegen. Aus diesen Gründen lag der Fokus bei der Erstellung dieser Arbeit auf der Entwicklung und Validierung ausgewählter Analysemethoden basierend auf einer modernen und robusten LC-GC-Kopplung. Hauptaugenmerk war dabei stets die Eignung der entwickelten Methoden in Routineumgebungen. Hoher Probendurchsatz war genauso wichtig wie eine robuste, präzise und richtige Analytik. Die ausgewählten Applikationen umfassen Beispiele aus dem Bereich der Kontaminantenanalytik, der Qualitätskontrolle von Speiseölen und -fetten sowie der Bestimmung des Vitamin D-Gehaltes ausgewählter Lebensmittel. Die LC-GC-Kopplung erlaubt in vielen Fällen die Direktinjektion von Proben, für welche im Normalfall zeitaufwendige Säulenchromatographien notwendig sind. Methoden, die üblicherweise vorhergehende Probenvorbereitungsschritte, wie Verseifungen, Derivatisierungen oder Flüssig-flüssig-Extraktionen, benötigen, können erfolgreich durch die Einbindung von Probenrobotern (Autosamplern) automatisiert werden. Die Bestimmung der Sterinverteilung und des Gesamtgehaltes in Speiseölen und -fetten wurde im Rahmen dieser Dissertation als Beispiel gewählt und beschrieben. Die manuelle Standardmethode beinhaltet eine mehrstufige, zeit- und arbeitsaufwendige Probenvorbereitung. Ringversuche belegen regelmäßig, dass die erzielte Vergleichspräzision oft ungenügend ist. Im Gegensatz dazu konnte durch eine LC-GC-Methode mit vorgeschalteter automatisierter Probenvorbereitung eine erhebliche Steigerung der Präzision, Richtigkeit und des Probendurchsatzes erzielt werden. Der durchschnittliche Probendurchsatz lag bei einer Probe pro Stunde, wobei der einzige manuelle Schritt nur noch aus der Probeneinwaage bestand. Dies stellt einen signifikanten Vorteil zur Standardmethode dar, sodass die hier vorgestellte Applikation für Auftragslabore prädestiniert erscheint. Abschließend konnte durch die analytischen Vorteile einer LC-GC-MS-Methode die Identität eines vorher unbekannten Sterins aus Sonnenblumenöl näher beschrieben werden. Die Bestimmung des Vitamin D-Gehaltes aus ausgewählten Lebensmitteln stellt ein weiteres Beispiel einer erfolgreichen LC-GC-Kopplung dar. Während sich für diese Analytik in der Vergangenheit ausschließlich HPLC-Methoden durchgesetzt haben, die für komplexe Lebensmittel, wie cholesterinsenkende Margarinen, teilweise ungeeignet sind, konnte mit einer LC-GC-MS-Methode der Vitamin D-Gehalt jener Lebensmittel effizient bestimmt werden. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Lösungsstrategien zur Behebung LC-GC-spezifischer Unzulänglichkeiten erarbeitet. Bei der Bestimmung aromatischer Kohlenwasserstoffe in einer Vielzahl von Lebensmitteln stellte sich eine Probenaufreinigung mittels einfacher HPLC als nicht zielführend heraus. Dies ermahnte, dass eine LC-GC-Kopplung wie jedes andere analytische Werkzeug stets an die analytische Fragestellung adaptiert werden muss. Die Verbesserung der Aufreinigungsqualität war daher eine zwingende Notwendigkeit. Die Bestimmung polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) konnte effizient erfolgen, indem eine einfache und generische Probenvorbereitung mit einer zwei-dimensionalen heart-cut HPLC-Aufreinigung gekoppelt wurde. Die Aufreinigungsqualität für komplexe Lebensmittel, wie Speiseöle, Kaffees, Tees oder Hühnereier, konnte hierdurch signifikant gesteigert werden. Eine umfassende Methodenvalidierung auf der Matrix „Olivenöl“ belegte die Präzision, Richtigkeit und Robustheit dieses Ansatzes. Selektive Derivatisierungsreaktionen störender Matrixbestandteile wurden zur Bestimmung aromatischer Kohlenwasserstoffe aus Mineralölen (MOAH) für die Probenmatrix „Speiseöle und -fette“ untersucht, weil sich ein HPLC-Aufreinigungsansatz als ungenügend erwies. Im Verlauf der Arbeiten stellte sich heraus, dass eine robuste Analytik nur durch eine präzise Reaktionsführung möglich war. Diese konnte durch die etablierte Autosamplerbasis mit anschließender LC-GC-Kopplung sichergestellt werden. Abschließend zusammengefasst, wird in dieser Arbeit gezeigt, dass eine moderne LC-GC-Kopplung für den Einsatz in Routineumgebungen vom analytischen Standpunkt umfassend geeignet erscheint. Die Erweiterung dieser Technik um bekannte und bewährte Probenvorbereitungsschritte eröffnet überdies neue Möglichkeiten, wie am Beispiel der Sterinbestimmung gezeigt werden kann. Für einen flächendeckenden Einsatz der LC-GC-Technik in Routineumgebungen sind jedoch neben der analytischen Eignung ausführliche Normierungsarbeiten nationaler Behörden bzw. der verantwortlichen Arbeitsgruppen notwendig.

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Nestola, Marco: Multidimensional high-performance liquid chromatography–gas chromatography (HPLC-GC) hyphenation techniques for food analysis in routine environments. 2016.

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