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Etablierung eines induzierbaren Zellkulturmodells zur Untersuchung transkriptioneller Interferenz

Heinz, Helena

Als transkriptionelle Interferenz (TI) wird die direkte Unterdrückung eines Transkriptionsprozesses durch einen anderen in cis bezeichnet. TI ist ein weit verbreiteter Mechanismus zur Transkriptionsregulation, der durch Transkription von konvergenten, divergierenden oder im Tandem angeordneten Promotoren hervorgerufen werden kann. Bei Säugetieren ist die TI auch an der Regulation der Expression von Genen beteiligt, die der genomischen Prägung unterliegen. In Neuronen der Maus und des Menschen wird das geprägte Gen Ube3a ausschließlich vom maternal ererbten Allel exprimiert. Auf dem paternalen Allel überlappt die Transkription der langen nicht-kodierenden RNA Snhg14 mit dem Ube3a-Gen und führt durch TI zur monoallelischen Ube3a-Expression. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Etablierung eines Zellkulturmodells, welches die Untersuchung von TI mit beliebigen humanen Promotoren erlaubt. Hierfür wurden die Promotoren der Gene UBE3A, HBA2 und MSH2 als Testpromotoren ausgewählt und ihre Aktivität zunächst mittels Luciferaseaktivitätsmessungen in humanen, transient transfizierten Flp-In™-T-REx™-293-Zellen bestimmt. Für die Etablierung des Zellkulturmodells wurden die Testpromotoren zusammen mit dem EGFP-Gen stromabwärts eines induzierbaren CMV-Promotors integriert, welcher die Expression des überlappenden β-Globin-Transkripts Exon_2/3 steuert. Die Testpromotoren UBE3A und HBA2 wurden dabei in konvergenter Richtung zum CMV-Promotor inseriert, während der MSH2-Promotor in Tandem-Orientierung positioniert wurde. Durch die Zugabe von Doxycyclin für drei, sieben, zehn und 14 Tage wurde der CMV-Promotor in der jeweiligen stabilen Flp-In™-T-REx™-293-Zelllinie induziert und die Auswirkungen auf die Exon_2/3- und EGFP-Expression mittels qRT-PCR analysiert. Dabei zeigte sich in allen untersuchten Zelllinien und zu allen Zeitpunkten eine Zunahme der Exon_2/3-Expression, da dieses Transkript durch den mit Doxycyclin induzierbaren CMV-Promotor gesteuert wird. Die EGFP-Expression, welche in dem etablierten Zellkulturmodell durch den jeweiligen Testpromotor kontrolliert wird, war in diesen Zellen hingegen reduziert. Die Reduktion der EGFP-Expression erfolgte durch TI und konnte auch durch eine Abnahme der EGFP-Fluoreszenz mittels Mikroskopie beobachtet werden. Der stärkste TI-Effekt wurde mit dem integrierten UBE3A-Testpromotor bestimmt, gefolgt von den Promotoren von HBA2 und MSH2. Die Ergebnisse zeigen, dass sich das etablierte Zellkulturmodell für die Untersuchung von TI eignet und die Stärke des beobachteten TI-Effekts abhängig vom integrierten Promotor ist. Zudem ergaben weitere Untersuchungen, dass der TI-Effekt im etablierten Modell reversibel ist und keine Methylierung der Testpromotoren hervorgerufen wurde.

Transcriptional interference (TI) is the direct and in cis suppression of one transcriptional process by another. It is a widespread transcriptional regulation mechanism that can be caused by transcription from convergent, divergent, or tandem promoters. In mammals, TI is also involved in the regulation of imprinted gene expression. An imprinted gene that is only maternally expressed in murine and human neurons is Ube3a. On the paternal allele, transcription of the long non-coding RNA Snhg14 overlaps with the Ube3a gene and leads to the silencing of paternal Ube3a expression through TI. In this study, an inducible cell culture model was established which allows the investigation of TI with any human promoter. The promoters of UBE3A, HBA2 und MSH2 were chosen as test promoters and their activity was determined by luciferase reporter assays in transiently transfected human Flp-In™ T-REx™ 293 cells prior to the establishment of this cell culture model. These test promoters together with EGFP were cloned downstream of an inducible CMV promoter which drives the expression of an overlapping β-globin transcript named exon_2/3. The test promoters UBE3A and HBA2 were integrated in convergent orientation with the CMV promoter, whereas the MSH2 promoter was positioned in tandem orientation. After generation of stable cell lines of Flp-In™ T-REx™ 293 cells, the CMV promoter was induced by addition of doxycycline for three, seven, ten and 14 days and the influence on the expression of exon_2/3 and EGFP was determined by qRT-PCR analysis. Since the exon_2/3 transcript is controlled by the inducible CMV promoter, the expression of exon_2/3 was increased in all of the investigated cell lines at any time point compared to untreated controls. In contrast, the EGFP expression, which is driven by the test promoter, was reduced in these cells due to TI. These results were confirmed by a decrease of EGFP fluorescence by cell microscopy. The strongest TI effect was observed for the UBE3A test promoter, followed by the promoters of HBA2 and MSH2. Since the strength of the investigated TI effect was dependent on the integrated promoter, the established cell culture model is suitable for studying TI with any human promoter. The results also showed that the effect of TI is reversible in the established model and that the test promoters did not gain methylation.

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Heinz, Helena: Etablierung eines induzierbaren Zellkulturmodells zur Untersuchung transkriptioneller Interferenz. 2016.

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