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Towards understanding bacterial induced sepsis : RNA recognition by murine TLR13 and human TLR8

Krüger, Anne

Immune defense against infection depends on recognition of invading pathogens by innate pattern recognition receptors (PRRs) localized in the plasma- or endosomal membrane and the cytoplasm. Toll-like receptors (TLR) are an important family of PRRs detecting bacterial pathogen associated molecular patterns (PAMPs). Blood borne bacteria tend to over-amplify inflammatory signals upon infections, which often causes septic shock. Blockade of TLR2 and -4 in combination with antibiotic therapy efficiently inhibits sepsis pathology upon Gram-negative bacterial infection in mice. Major host receptors of Gram-positive bacteria beyond TLR2 had not been identified previously. Here, I show that recognition and killing of Gram-positive bacteria by macrophages depends on an endosomal TLR beyond TLR3, -7, -8, -9, -11 and -12. Immune activation upon Streptococcus pneumoniae D39 infection or heat inactivated Staphylococcus aureus (hiSa) challenge was abrogated in murine MyD88/Trif-/- bone marrow derived macrophages (BMMs). In contrast, Tlr23479-/- BMMs recognized and killed these bacteria like wt cells, yet 3D/Tlr24-/- BMMs lacking endosomal TLR function were impaired in both. According to common view, the bactericidal activity of host cells involves production of reactive oxygen species (ROS) or nitric oxide (NO). However, p47/Phox-/- and iNOS-/- BMMs were unremarkably competent in S. pneumoniae D39 killing. Bacterial recognition and killing capacity was carried by cell culture supernatants since bacteria were killed when confronted with cell free supernatant from pre-stimulated wt BMMs, indicating extracellular killing independent of phagocytosis. My results suggest involvement of other effector molecules such as antimicrobial peptides in macrophage bactericidal activity. I also show that murine TLR13 recognizes a conserved bacterial 23S ribosomal (r)RNA segment of 10 nt (5'-CGGAAAGACC-3') which also binds macrolide, lincosamide and streptogramin (MLS) antibiotics (including erythromycin). RNase A treatment of hiSa abrogated Tlr23479-/- cell activation. Consequent analysis of bacterial ssRNA molecular subspecies indicated 23S rRNA as TLR13 ligand. Detection of S. aureus RNA was conferred by TLR13 upon its over expression in HEK293 cells, while its mRNA knockdown upon siRNA transfection into BMMs abrogated it. The TLR13 activating 23S rRNA segment contains adenosine (A)2085 in S. aureus. Its N6-adenosine methylation or mutation mediated by specific methyltransferases (ErmC and ErmB) is known to confer antibiotic resistance and at once abrogated activation of TLR13. Hence, 23S rRNA from erythromycin resistant clinical S. aureus isolates grown in the presence of erythromycin as well as synthetic oligoribonucleotides (ORN) methylated at the respective adenosine or mutated towards guanosine mimicking resistance conferring modifications failed to activate TLR13. Over expression of ErmB or ErmC in erythromycin susceptible bacteria resulted in N6-adenosine methylation as shown by HPLC and masking towards TLR13. Thus, my data identify both TLR13 and its highly conserved ligand, as well as a mechanisms of antibiotic resistance qualifying as bacterial immune escape strategy to avoid TLR13 driven recognition. Furthermore, I show that human TLR8 not only replaces TLR13 but also exceeds its specificity by promiscuously sensing bacterial and mitochondrial rRNA in a merely URR motif dependent manner. RNase A treated hiSa activated hPBMCs only via TLR2, implying ssRNA as major immune stimulant. PBMCs were MyD88 dependently activated by bacterial 23S (Sa19) or mitochondrial Sa19-like 16S rRNA (BtmtD3_4) derived ORNs also when methylated or mutated, as well as by all bacterial rRNAs. Comparative transcriptome profiling of Sa19 responsive differentiated human monocytoid THP-1 cells indicated correlation of TLR8 expression with Sa19 responsiveness. Accordingly, Unc93b1-/-- and Tlr8-/--THP-1 cells as well as siRNA driven knockdown and ectopic TLR8 expression confirmed this statement. Responsiveness of Tlr8-/-- and Unc93b1-/- THP-1 cells towards bacterial infection was abrogated upon TLR2 blockade (mAb T2.5). Additional endosomal inhibition (chloroquine) resulted in a substantial decrease of PBMC activation. Endosome inhibition by chloroquine and simultaneous antibiotic treatment efficiently inhibited bacterial infection driven inflammatory activity of human whole blood. Therapy at the early phase of bacterial sepsis might thus benefit from TLR8 and -2 blockade besides antibiotic therapy.

Die Immunabwehr gegen Infektionen hängt von der Erkennung invasiver Pathogene durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ab, die in der Plasma- oder endosomalen Membran bzw. im Zytoplasma lokalisiert sind. Toll-like Rezeptoren (TLR) bilden eine wichtige PRR Familie, die z. B. bakterielle Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) erkennt. Das angeborene Immunsystem immunsupprimierter Individuen tendiert zu überschießenden inflammatorischen Reaktionen auf bakterielle Infektionen. TLR2 und -4 Blockade kombiniert mit Antibiotika-Gabe schützt mit Gram-negativen Bakterien infizierte Mäuse vor Sepsispathologie. Spezifische Wirtsrezeptoren für Gram-positive Bakterien von TLR2-ähnlicher Wichtigkeit waren zuvor unbekannt. Ich zeige hier, dass die Erkennung und Abtötung Gram-positiver Bakterien durch Makrophagen in Abhängigkeit eines endosomalen TLR, jenseits von TLR3, -7, -8, -9, -11 und -12 erfolgt. Immunaktivierung durch eine Streptococcus pneumoniae D39 Infektion oder eine Konfrontation mit Hitze-inaktiviertem Staphylococcus aureus (hiSa) war in murinen MyD88/Trif-/- Knochenmarksmakrophagen (BMM) abwesend. Tlr23479-/- und wt BMM erkannten und töteten die Bakterien gleichermaßen. 3D/Tlr24-/- BMM, deren endosomale TLR unfunktional sind, waren in beiderlei Hinsicht nahezu inaktiv. Die bakterizidale Aktivität hängt insofern lediglich in geringem Maße von der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies oder Stickstoffmonoxid (NO) ab, als dass p47/Phox-/- und iNOS-/- BMMs normal reagierten. Die Erkennung und Eliminierung der Bakterien wurde anhand der Zahl lebender Bakterien sowie des Gehaltes an NO und Zytokinen in Kulturüberständen untersucht. Bakterien wurden bereits durch die Konfrontation mit zellfreien Überständen von vor-stimulierten wt BMM abgetötet. Dies spricht für eine Phagozytose-unabhängige und extrazelluläre Abtötung. Dieses Ergebnis impliziert eine Beteiligung anderer Effektormechanismen an der bakterizidalen Aktivität von Makrophagen, wie möglicherweise die Freisetzung antimikrobieller Peptide. Ich zeige hier auch, dass der murine TLR13 ein hochkonserviertes 23S rRNA Segment einer Länge von 10 nt (5'-CGGAAAGACC-3') erkennt, das ebenso eine Bindestelle von Makrolid, Lincosamid und Streptogramin (MLS) Antibiotika ist. RNase A Behandlung von hiSa hob seine Aktivierung in Tlr23479-/- BMM auf. Die Untersuchung bakterieller RNA Subspezies identifizierte 23S rRNA als TLR13 Ligand. TLR13 Überexpression in HEK293 Zellen und Knockdown mittels siRNA in BMM wies ebenfalls darauf hin. Das TLR13 aktivierende 23S rRNA Segment beinhaltet ein Adenosin (A)2085 in S. aureus, welches sich in der Erythromycin-Bindestelle befindet. Dessen N6-Methylierung durch spezifische Methyltransferasen (ErmB und ErmC) oder Mutation vermittelt Antibiotikaresistenz und hob TLR13 Aktivierung auf. 23S rRNA Erythromycin resistenter klinischer S. aureus Isolate und synthetische Oligoribonukleotide (ORN), die eine Adenosin-Methylierung bzw. Mutation (A→G) tragen um Resistenz-vermittelnde RNA-Modifikationen zu immitieren, aktivierten TLR13 nicht. Überexpression von ErmB oder ErmC in zuvor Erythromycin sensitiven Bakterien hatte den gleichen Effekt. Die N6-Adenosin Methylierung war mittels HPLC von 23S rRNA darstellbar. Meine Daten identifizieren daher sowohl einen hochkonservierten TLR13 Liganden, als auch dass Antibiotikaresistenzmechanismen als bakterielle Immunevasions-Strategien wirksam sind. Desweiteren zeige ich, dass humaner TLR8 im Gegensatz zu murinem TLR13 jegliche bakterielle und auch mitochondrielle rRNA erkennt. Die TLR2 abhängige PBMC Aktivierung durch RNase A behandelten hiSa implizierte ssRNA als stimulatives PAMP. PBMC wurden in Abhängigkeit von MyD88 durch bakterielle 23S (Sa19) oder mitochondrielle 16S rRNA (BtmtD3_4, Sa19 abgeleitetes ORN) aktiviert, auch wenn diese methyliert oder mutiert waren, sowie durch alle bakteriellen rRNAs. Das ermittelte Konsensus Motiv ist UR/URR. Eine vergleichende Transkriptomanalyse von Sa19 responsiven differenzierten humanen monozytoiden THP-1 Zellen im Vergleich mit Kontrollen implizierte TLR8. Unresponsive Unc93b1-/-- und Tlr8-/--THP-1 Zellen, sowie siRNA vermittelter Knockdown und ektopische TLR8 Überexpression implizierten ebenfalls TLR8 als Rezeptor. Die Aktivierung von Tlr8-/-- and Unc93b1-/- THP-1 Zellen durch bakteriellen Infektionen wurde von einer TLR2 Blockade (mittels mAb T2.5) verhindert. Zusätzliche endosomale Hemmung (Chloroquin) führte in PBMC zu substantiell verminderter Aktivierung. Eine TLR8 Blockade mittels Verabreichung von Chloroquin und zeitgleicher Antibiotikabehandlung verhinderte die Bakterien getriebene endzündliche Immunaktivität einer humanen Vollblutkultur. Die kombinierte TLR8 und -2 Blockade mit Antibiotika Gabe könnte unseren Daten zufolge der Therapie der frühen Phase bakteriell induzierter Sepsis zuträglich sein.

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Krüger, Anne: Towards understanding bacterial induced sepsis. RNA recognition by murine TLR13 and human TLR8. 2016.

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