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Untersuchungen zur Bedeutung der DNA-Methylierung und methylierungsmodulierender Enzyme in verschiedenen Zellsystemen

Grosser, Christian

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der DNA-Methylierung und methylierungsmodulierender Enzyme in verschiedenen Geweben untersucht. Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit sind reduzierte Somatostatin- und Somatostatin-Rezeptor-Level im Gehirn, die mit dem Ausbruch der sporadischen Form der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Um zu klären, ob die Reduktion des Peptidhormons Somatostatin (SST) und des im Kortex von Alzheimer-Patienten am stärksten reduzierten Rezeptor-Subtyps 4 (SSTR4) auf eine Hypermethylierung der entsprechenden Promotorregion zurückzuführen sein könnte, wurden diese Regionen mittels Bisulfit-Sequenzierung in Zellen von Alzheimer-Patienten und nicht-dementen Normalpersonen analysiert. Die ähnlichen Methylierungslevel dieser Promotorregionen in verschiedenen Gehirnregionen von Patienten und nicht-dementen Normalpersonen unterstützen jedoch nicht die Hypothese eines Zusammenhangs von DNA-Hypermethylierung und den reduzierten SST- und SSTR4-Leveln einer Alzheimer-Erkrankung. Es fand sich jedoch ein Trend zu erhöhter Methylierung des SST-Promotors mit erhöhtem Alter. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden drei unabhängige transgene Linien eines Mausmodells zur ubiquitären Überexpression der somatischen Form der DNA Methyltransferase 1, Dnmt1s, untersucht. Anhand dieses Modells sollten ursprünglich die Konsequenzen einer solchen Überexpression analysiert werden. Es stellte sich heraus, dass transgene Tiere zwar eine bis zu 229-fach erhöhte Dnmt1-mRNA-Expression aufwiesen, jedoch keine erhöhten Dnmt1-Proteinlevel besaßen. Reportergenversuche weisen auf eine reduzierte Translationseffizienz des Transgenkonstrukts hin, die jedoch nicht allein das Ausbleiben erhöhter Proteinlevel im Mausmodell erklären kann. Es bleibt offen, ob die statischen Proteinlevel auf spezifische Eigenschaften des Transgens oder auf eine stringente Kontrolle der Dnmt1-Level in vivo zurückzuführen sind. Im Hauptteil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss moderat veränderter TET-Dioxygenase-Level auf HEK293-Zellen untersucht. Die Überexpression von TET1 führte zu erhöhten globalen 5hmC-Leveln und verursachte eine leichte Hypomethylierung von Promotoren, Genen und CpG-islands. Im Gegensatz dazu führte der simultane Knockdown von TET1, TET2 und TET3 zu verringerten globalen 5hmC-Leveln und einer leichten Hypermethylierung der genannten Regionen. Auch wenn die Überexpressions- bzw. Knockdown-Experimente entgegengesetzte Methylierungsveränderungen hervorriefen, gab es nur eine kleine Anzahl reziproker Veränderungen. Die Methylierungsveränderungen beider Experimente geschahen mit unterschiedlicher Präferenz in Abhängigkeit vom endogenen Methylierungsgrad und der Stärke der Genexpression. Sowohl nach der TET1-Überexpression als auch nach dem TET-Knockdown wurden geringfügig hoch- und herunterregulierte Gene identifiziert. Die Expressionsveränderungen konnten jedoch nicht mit Methylierungsveränderungen der Genpromotoren in Verbindung gebracht werden und sind womöglich auf nicht-katalytische Funktionen der TET-Enzyme zurückzuführen. Die Kartierung der 5hmC-DNA-Modifikation im genomweiten Maßstab zeigte, dass die TET1-Überexpression die genomweite 5mC-Oxidation ohne einen erkennbaren Verteilungsschwerpunkt induzierte. Detailliertere Analysen offenbarten den Trend einer unterschiedlichen Suszeptibilität für eine Oxidation durch TET1, der abhängig vom endogenen 5hmC-Vorkommen war und in allen untersuchten genomischen Elementen und Regionen vorlag. Zusammengenommen weisen die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen auf eine ausgedehnte Rolle der TET-Familie bei der Regulation der DNA-Methylierungslevel hin.

This thesis focused on elucidating the relevance of DNA methylation and methylation-modulating enzymes in different tissues. Reduced levels of somatostatin (SST) and its receptors represent pathological characteristics of Alzheimer’s disease (AD) brains, and deregulated somatostatin signaling has been proposed to play a major role in the development of late-onset sporadic AD. To investigate whether the reduced levels of somatostatin and its most affected receptor subtype 4 (SSTR4) could be caused by DNA hypermethylation of the respective promoter regions, these regions were analyzed in cells from the neocortex of AD patients and non-demented controls using bisulfite sequencing. Tissue samples from two areas of the neocortex were analyzed, each separated into cortical gray and infracortical white matter. However, the similar methylation levels observed in the SST and SSTR4 promoter regions in all samples from AD patients and non-demented controls are not supportive of a causal role of DNA hypermethylation with respect to altered somatostatin signaling in AD. But there was a trend toward increased SST promoter methylation with increasing age. Consequences of ubiquitous overexpression of the somatic form of the DNA methyltransferase 1, Dnmt1s, were supposed to be studied in a transgenic mouse model. Three independent lines of this model were analyzed. Transgenic mice ubiquitously overexpressed Dnmt1 mRNA up to 229-fold, but were lacking increased protein levels. Although reporter gene assays indicated a reduced translation efficiency of the transgene construct, this reduction was not strong enough to solely account for the lack of protein increase in the mouse model. It remains unclear whether the static protein levels are due to intrinsic features of the transgene or a stringent control of Dnmt1 levels in vivo. The main part of this thesis shows that altering TET dioxygenase levels within physiological range can affect DNA methylation levels of HEK293 cells. TET1 overexpression led to increased global 5hmC levels and mild hypomethylation of promoters, gene bodies and CpG islands. Conversely, the simultaneous knockdown of TET1, TET2 and TET3 led to decreased global 5hmC levels and was accompanied by mild hypermethylation of above-mentioned regions. Although the overexpression and knockdown studies caused opposite methylation changes, most changes were non-reciprocal and occurred with different preference depending on endogenous methylation and gene expression levels. Both, TET1 overexpression and TET knockdown, led to slight transcriptional up- and downregulation. However, the expression changes could not be linked to methylation changes of the corresponding gene promoters and were probably caused by non-catalytic functions of the TET enzymes. 5hmC profiling performed on a genome-wide scale showed that TET1 overexpression induced 5mC oxidation without a distribution bias. Detailed analyses revealed a trend of different susceptibility to TET1-induced oxidation that was linked to endogenous 5hmC content and found in all genomic elements and regions. Taken together, the experiments conducted point to a widespread role of the TET family in regulating DNA methylation levels.

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Grosser, Christian: Untersuchungen zur Bedeutung der DNA-Methylierung und methylierungsmodulierender Enzyme in verschiedenen Zellsystemen. 2016.

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