Dynamic regulation of Rho GTPase networks and correlation with effector pathways

Gräßl, Melanie GND

Cells can explore their environment and respond to different extracellular signals by activating distinct intracellular pathways. In eukaryotic cells, the actin cytoskeleton builds the foundation for dynamic cell behavior as it is able to reorganize rapidly to drive cell shape changes. As a counterbalance to actin based protrusions, myosin-decorated actin stress fibers that are able to generate cellular contractility have been linked to cellular mechanosensing in multiple processes such as cell adhesion, proliferation and differentiation. However, how these signaling pathways are coordinated precisely in space and time is not fully understood. During the last years, excitable activator-inhibitor signal networks that comprise signal self-amplification and delayed inhibitory feedback loops have been reported in different types of eukaryotic cells, implicating their relevance in dynamic cell behavior. In this work, a novel excitable signal network generating Rho activity oscillations was identified and characterized in detail. TIRF microscopy and low-expression constructs such as a domain based Rho activity sensor, fluorescently tagged regulatory proteins and well established effectors were used to characterize signal oscillations and to perform crosscorrelation analyses. In addition, RNAi based depletion and pharmacological manipulations were applied to further characterize the role of potential network components. Rho activity oscillations strongly correlated with subcellular oscillations of actin, myosin-IIa and the stress fiber associated formin FHOD1. Interestingly, myosin-IIa oscillations were significantly time-delayed as compared to Rho activation and inhibition of ROCK and myosin-II, respectively, lead to substantially perturbed Rho activity dynamics. In contrast, FHOD1 depletion did not affect Rho and myosin-IIa, but only actin oscillations. Thus, while FHOD1 seems not to play a regulatory role in the Rho based excitable network, myosin- IIa activity might facilitate a negative feedback to control time-delayed Rho inhibition. Based on crosscorrelation analysis, overexpression and siRNA-depletion, two RhoGAPs, ARHGAP18 and Myosin9b, are proposed to mediate this time delayed inhibition of Rho by myosin-II. Overall, we have identified an excitable activator-inhibitor network generating Rho activity oscillations and propose that the GTPase self-amplifies its activity by recruiting GEF activators and controls its own inhibition by myosin-II dependent time-delayed activation of multiple RhoGAPs. Using elastomeric surfaces with different rigidities we further provide evidence that Rho and acto-myosin based signal oscillations play a critical role in mechanosensing and thus contribute to exploratory processes such as cell spreading and durotaxis.

Zellen erkunden ihre Umgebung und sind in der Lage auf extrazelluläre Signale mit der Aktivierung spezifischer Signalwege zu reagieren. In eukaryotischen Zellen bildet das Aktin Zytoskelett die Grundlage für dynamische Zellprozesse, da es durch aktive Umstrukturierungen rasche Veränderungen der Zellmorphologie ermöglicht. Insbesondere das Zusammenspiel zwischen Aktin-basierten Ausstülpungen der Plasmamembran und Myosin-assoziierten, kontraktilen Stressfasern steht in direktem Zusammenhang mit der zellulären Mechanotransduktion in Prozessen wie der Zelladhäsion, Proliferation oder Differenzierung. Die präzise räumliche und zeitliche Koordination dieser Signalwege ist jedoch nicht vollständig erforscht. In den letzten Jahren wurden Studien zu Aktivator-Inhibitor Signalnetzwerken, bestehend aus einer signalverstärkenden und einer verzögerten, inhibierenden Rückkopplung, in verschiedenen Zellentypen veröffentlicht, die auf ihre Relevanz für dynamische Zellprozesse hindeuten. In dieser Arbeit wurde erstmalig ein anregbares Signalnetzwerk identifiziert, das Oszillationen lokaler Rho Aktivität in U2OS Zellen hervorruft. Diese wurden mittels TIRF Mikroskopie und Kreuzkorrelationsanalysen eines gering-exprimierten Rho Aktivitätssensor und fluoreszenzmarkierter Regulator- und Effektor-Proteinen charakterisiert. Zusätzlich wurden RNAi und pharmakologische Wirkstoffe eingesetzt, um die Rolle der einzelnen Netzwerkkomponenten zu entschlüsseln. Rho Aktivitätsoszillationen korrelierten stark mit intrazellulären Oszillationen von Aktin, Myosin-IIa und dem Stressfaser-assoziiertem Formin FHOD1. Dabei traten Myosin-IIa Oszillationen deutlich verzögert zu Rho Oszillationen auf, die zudem durch die Inhibition von ROCK oder Myosin-IIa stark verringert wurden. Die Depletion von FHOD1 hingegen, hatte keinen Einfluss auf Oszillationen von Rho oder Myosin-IIa, aber auf Aktin Oszillationen. FHOD1 hat demzufolge keine regulatorische Funktion in dem beschriebenen Netzwerk, während Myosin-IIa Rho Oszillationen über eine zeitverzögerte Rückkopplung inhibiert. Kreuzkorrelations-, Expressions- und Depletionsstudien deuten darauf hin, dass diese Rückkopplung durch zwei RhoGAPs, ARHGAP18 und Myosin9b, vermittelt wird. Insgesamt wurde ein Aktivator-Inhibitor Netzwerk identifiziert, das Rho Aktivitätsoszillationen generiert und sich selbst verstärkt, indem es Aktivatoren (GEFs) rekrutiert, und inhibiert, indem es Myosin-IIa und verschiedenen GAPs aktiviert. Experimente mit elastischen Oberflächen verschiedener Härtegrade lieferten zudem Hinweise, dass die von Rho und Actomyosin vermittelten Signaloszillationen zur Mechanotransduktion beitragen und somit an zellulären Prozessen wie der Migration oder Zell-Ausbreitung beteiligt sind.

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Gräßl, M., 2020. Dynamic regulation of Rho GTPase networks and correlation with effector pathways. https://doi.org/10.17185/duepublico/41005
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