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Funktionalisierte Calciumphosphat-Nanopartikel als Instrument zum Eingriff in die Proteinbiosynthese und deren therapeutische Anwendung

Neuhaus, Bernhard

In dieser Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel synthetisiert und mit unterschiedlichen Nukleinsäuren funktionalisiert. Die Nanopartikel dienten dabei als Transportvehikel, um die Nukleinsäure ins Innere von Zellen zu schleusen. Zunächst wurde die Transfizierbarkeit von neun Zelllinien und hMSC untersucht. Die Zellen sollten dafür mit dem grün fluoreszierenden Protein eGFP transfiziert werden, sodass eine erfolgreiche Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskop detektierbar war. Die Transfektionseffizienz der Nanopartikel wurde dabei mit der Transfektionseffizienz des kommerziell erhältlichen Transfektionsagenz Lipofectamine® 2000 verglichen. Zwar konnten die Zellen mit Lipofectamine® 2000 am effizientesten transfiziert werden, jedoch lieferten die Nanopartikel ähnlich gute Transfektionseffizienzen. Damit stellten die Nanopartikel in vitro ein potentes Transfektionsagenz dar. Einige Zellen waren dabei gut transfizierbar, während andere Zelltypen nur schlecht oder gar nicht transfiziert wurden. Die Zellen, die gut transfiziert wurden, waren auch diejenigen Zelllinien, die sich schnell teilten. Weiterhin stellte sich heraus, dass gut transfizierte Zellen unabhängig vom Transfektionsagenz auch mit einer erhöhten Toxizität auf die Transfektionsagenzien reagierten. So konnte eine Korrelation zwischen Transfektionseffizienz und Toxizität gefunden werden, die auf einen gemeinsamen Parameter hindeutete. In der Literatur gibt es ähnliche Hinweise, die hier in einer breit angelegten Studie mit vielen unterschiedlichen Zelltypen gezeigt werden konnten. Der Parameter, der sowohl Transfektionseffizienz als auch Toxizität verbindet, ist, falls existent, bisher noch unbekannt. Anschließend wurde die Transfektion von zwei Zelllinien mittels FACS und qPCR untersucht. Obwohl es sich dabei um andere Zellpassagen und eine andere Partikelcharge handelte, ließen sich die Ergebnisse gut reproduzieren. Die Transfektion konnte so auf Proteinebene und mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Im Anschluss wurden die Partikel in vivo zur Transfektion von Zellen im Darm von BALB/c-Mäusen eingesetzt. Dazu wurde eine Dispersion der Nanopartikel rektal appliziert. Es zeigte sich, dass eine Transfektion mittels Nanopartikel durchaus möglich war. Die Epithelzellen exprimierten eGFP innerhalb der ersten beiden Tage nach der Transfektion. Außerdem konnte die Expression mittels FACS und qPCR nachgewiesen werden. Die Transfektionseffizienz war in vivo deutlich geringer als in vitro, jedoch waren Nanopartikel hier etwas besser als Lipofectamine® 2000. Im anschließenden Kapitel wurde die Stummschaltung von entzündungsrelevanten Genen mittels Calciumphosphat-Nanopartikeln untersucht. Dazu wurden fünf verschiedene auf Calciumphosphat-basierende Nanopartikelsorten mit siRNA funktionalisiert. Zunächst wurde die Stummschaltung von eGFP in HeLa-eGFP-Zellen mittels fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen, FACS und qPCR untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die mittels FACS und qPCR erhaltenen Ergebnisse weitestgehend miteinander korrelierten. Die durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen erhaltenen Ergebnisse hingegen wichen ab. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass im Mikroskop nur Zellen, die gar kein Protein mehr exprimierten, als stummgeschaltet identifiziert werden konnten. FACS und qPCR hingegen konnten die Expression des Proteins genauer erfassen. Die erhaltenen Ergebnisse sollten auf die Stummschaltung des entzündungsrelevanten Proteins TNF-α übertragen werden. Hierzu wurden Mode-K-Zellen zunächst stimuliert, sodass sie verstärkt TNF-α exprimierten. Es stellte sich heraus, dass einige Partikelsorten eGFP stark herunterregulieren konnten, TNF-α allerdings nicht. Partikel des schematischen Aufbaus CaP-siRNA-CaP-PEI und CaP-siRNA-PLGA-PEI waren in beiden Fällen in der Lage, die Expression der Proteine zu verhindern. CaP-siRNA-CaP-PEI-Partikel konnten TNF-α ähnlich effizient herunterregulieren wie Lipofectamine® 2000. Somit ist die Effizienz auch ähnlich stark wie bei anderen in der Literatur bekannten Systemen, die ebenfalls mit Lipofectamine® 2000 verglichen wurden. Da die Verkapselungseffizienz von siRNA in CaP-siRNA-PLGA-PEI-Partikel am höchsten war, wurde dieses System zur therapeutischen Stummschaltung von entzündungsrelevanten Proteinen im DSS-Colitis-Mausmodell eingesetzt. In diesem Modell konnte das therapeutische Potential dieser Partikel zur Behandlung von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen gezeigt werden. Somit führte die Herunterregulierung der entzündungsrelevanten Gene mittels siRNA auch zu einer Verbesserung im Krankheitsbild der Mäuse. Im letzten Teil der Arbeit wurden Strategien zum Transport der Nanopartikel in den Darm entwickelt. Sollen die Nanopartikel über eine orale Aufnahme in den Darm gelangen, so müssen sie vor der Magensäure geschützt werden. Dazu wurden gefriergetrocknete Nanopartikel in eine Gelatinekapsel gefüllt und mit dem magensaftresistenten Polymer Eudragit® L 100 überzogen. Die Polymerschicht schützte die Nanopartikel zwar vor dem Abbau in der Magensäure, jedoch interagierte das Polymer nach Auflösung bei neutralen pH-Werten mit den positiv geladenen Nanopartikeln, sodass diese in der Zellkultur nicht mehr funktionell waren. Alternativ konnte ein Zäpfchen entwickelt werden, das die Nanopartikel nach rektaler Applikation im Darm freisetzen würde. In in vitro Versuchen stellte sich heraus, dass die Partikel nach Freisetzung aus einem Zäpfchen etwas schlechtere Stummschaltungseffizienzen aufwiesen als Nanopartikel, die als Dispersion eingesetzt wurden. Dennoch blieben hohe Stummschaltungseffizienzen erhalten.

Calcium phosphate nanoparticles were synthesized and functionalized with different nucleic acids. The calcium phosphate nanoparticles should serve as transport vehicle for nucleic acids across the plasma membrane of cells. The nanoparticles were functionalized with plasmid DNA (pDNA) in order to investigate the transfectability of different cell types. The pDNA encoded for green fluorescing protein (eGFP), therefore a successful transfection could be visualized via fluorescence microscopy. The transfection efficiency of the nanoparticles was compared with the commercially available transfection reagent Lipofectamine® 2000. Experiments with nine different cell lines and hMSC (human mesenchymal stem cells) revealed that most cells were most efficiently transfected with Lipofectamine® 2000, but that the nanoparticles transfected the cells with comparable efficiency. Thus, calcium phosphate nanoparticles represent a suitable in vitro transfection agent. However, not all cells were transfected with the same efficiency. Whereas some cell lines showed high transfection efficiency, others were hardly transfected and some were not even transfected at all. Apparently, cell lines with good transfection efficiencies were also the ones with a higher proliferation rate. Viability on the other hand was higher in the poorly transfected cell lines. These findings lead to a correlation between transfection efficiency and toxicity, which suggested a common parameter. This parameter, however, is not yet known. Similar conclusions are stated in the literature, but here they were shown in a broad range of different cells during simultaneous transfection. Subsequently, the transfection of two cell lines was investigated by FACS and qPCR. The results were well reproducible, although different cell passages and a different lot of nanoparticles were used. Thus, the transfection efficiency was verified on the protein level as well as the mRNA-level. Following these promising results, the particles were applied in vivo for the in vivo transfection of cells in the intestine of BALB/c-mice. A dispersion of nanoparticles was rectally injected and led to a transfection of intestinal cells. Epithelial cells expressed eGFP during the first two days post injection. The transfection was analyzed via FACS and qPCR. The transfection efficiency in vivo was lower than in vitro transfection efficiency, but nanoparticles were more efficient than Lipofectamine® 2000. The following chapter dealt with the silencing of pro-inflammatory genes with functionalized calcium phosphate nanoparticles. Five different kinds of nanoparticles were functionalized with siRNA. All different nanoparticles were based on calcium phosphate. The silencing of eGFP in HeLa-eGFP-cells was investigated first, using fluorescence microscopy, FACS and qPCR. The results from FACS and qPCR compared well to each other, but the results from fluorescence microscopy were different. Successful gene silencing was only detectable in completely silenced cells by microscopy, whereas protein levels were measured more quantitatively with qPCR and FACS. In order to silence the pro-inflammatory cytokine TNF-α, the expression of this protein was stimulated in Mode-K cells. Subsequently, nanoparticles were applied to inhibit the expression by gene silencing with siRNA. Some types of nanoparticles did not silence the expression of TNF-α, although they well silenced the expression of eGFP. However, both proteins were silenced by CaP-siRNA-CaP-PEI particles as well as by CaP-siRNA-PLGA-PEI particles. In the case of CaP-siRNA-CaP-PEI particles, the gene silencing efficiencies were comparable with the efficiency of Lipofectamine® 2000. The encapsulation efficiency of siRNA was highest in the CaP-siRNA-PLGA-PEI system. Therefore, this system was used for therapeutic gene silencing of pro-inflammatory proteins in the DSS-colitis mouse model. The therapeutic potential of the particles for the treatment of chronic inflammatory diseases was shown in this model. The silencing of pro-inflammatory genes during inflammation led to an amelioration of the symptoms. Besides the investigation of the effects of the nanoparticles, strategies for their delivery into the gut were developed. Oral application of the nanoparticles would lead to their dissolution in the acidic environment of the stomach. In order to protect the particles from this degradation, freeze-dried particles were filled into a gelatin capsule that was subsequently coated with the acid-resistant polymer Eudragit® L 100. Although the polymer indeed protected the nanoparticles from acidic degradation, it also interacted with the nanoparticles after its dissolution at neutral pH. The in vitro gene silencing efficiencies of the particles were strongly inhibited due to this interaction. Alternatively, a suppository dosage form was developed for rectal administration of the nanoparticles. Again, gene silencing efficiencies were inhibited after release from the suppository. An efficient gene silencing was still possible in this case.

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Neuhaus, Bernhard: Funktionalisierte Calciumphosphat-Nanopartikel als Instrument zum Eingriff in die Proteinbiosynthese und deren therapeutische Anwendung. 2016.

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