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Auswirkung einer postovulatorischen Alterung auf molekulare Parameter und die Entwicklungskompetenz muriner Oozyten

Dankert, Debora

Die postovulatorische Alterung wird durch eine verzögerte Fertilisation nach der Ovulation hervorgerufen und führt zu einem zeitabhängigen Qualitätsverlust der Oozyte. Dieser macht sich durch eine verringerte Fertilisations- und Implantationsrate, ausgelöst durch verschiedene veränderte zelluläre Prozesse, bemerkbar (Miao et al. 2009). Ziel dieser Arbeit war es, molekulare Parameter der postovulatorisch gealterten Oozyte sowie daraus resultierender 2-Zell-Embryonen weitergehend zu analysieren. Zunächst wurde durch qRT-PCR der Poly(A)-Anteil von 11 Maternaleffektgenen nach postovulatorischer Alterung untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass nach 24 h Alterung der Poly(A)-Schwanz von 6 maternalen Effektgenen im Vergleich zu Kontroll-Oozyten signifikant verkürzt war. Um diese Reduktion zu validieren und quantifizieren, wurde ein extension Poly(A) Test etabliert welcher die exakte Länge des Poly(A)-Schwanzes eines Transkripts misst. Dieser Test wurde repräsentativ für die Gene Dnmt1 und Zar1 durchgeführt. Dabei konnte für Dnmt1 eine Deadenylierung und für Zar1 keine Änderung der Länge des Poly(A)-Schwanzes nach 24 h postovulatorischer Alterung nachgewiesen werden. Diese Versuchsergebnisse bestätigten die Resultate der qRT-PCR und zeigten zudem, dass eine postovulatorische Alterung Einfluss auf die Poly(A)-Schwanzlänge von Maternaleffektgenen hat. Außerdem wurde durch immunhistologische Methoden eine signifikante Abnahme der Trimethylierung am H3K9 nach postovulatorischer Alterung ermittelt. Um zu untersuchen, ob die postovulatorische Alterung auch einen Effekt auf die frühe embryonale Entwicklung hat, wurden IVF Studien mit gealterten Oozyten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass nach 4, 6 und 8 h postovulatorischer Alterung keine Veränderungen in der relativen Anzahl an 2-Zell-Embryonen im Vergleich zu den Kontrollen detektiert werden konnten. Allerdings wurde durch mikroskopische Analysen festgestellt, dass die Anzahl an 2-Zell-Embryonen mit sichtbaren Spermien im perivitellinen Raum nach 8 h postovulatorischer Alterung im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöht war. Dies deutet auf eine veränderte Struktur der Zona pellucida nach postovulatorischer Alterung hin. Die Analyse der zygotische Genomaktivierung (ZGA) in 2-Zell-Embryonen zeigte, dass eine postovulatorische Alterung von 4 h zu einer vorzeitigen ZGA führte, während nach 6 und 8 h Alterung eine signifikant verzögerte ZGA auftrat. Zusammenfassend zeigen die Befunde der vorliegenden Arbeit, dass eine postovulatorische Alterung von Oozyten zu deutlichen molekularen Veränderungen in der Oozyte sowie auch in den daraus resultierenden Embryonen führt. Dies könnte schwerwiegende Folgen für die weitere Entwicklung des Embryos haben.

Postovulatory aging occurs if fertilization of the ovulated oocyte is delayed. During this delay, unfertilized oocytes undergo a time-dependent deterioration in quality, which results in lower fertilization- and implantation rates. The molecular mechanisms causing this decrease in oocyte competence comprises cell degradation including oxidative stress, chromosome anomalies and epigenetic changes (Miao et al. 2009). The aim of this study was to analyze molecular parameters of postovulatory aged oocytes and effects on their development to 2-cell embryos. For this, the poly(A)-content of 11 maternal-effect genes was investigated after postovulatory aging by qRT-PCR. Shortening of the poly(A)-tail was observed for 6 maternal-effect genes after 24 h postovulatory aging compared to controls. In order to validate this reduction, an extension poly(A) test was established to measure the exact lengths of the poly(A)-tails of the two representative maternal-effect genes Dnmt1 and Zar1. A reduction of poly(A)-tail length was observed for Dnmt1 whereas no changes in poly(A)-tail length for Zar1 were seen after 24 h postovulatory aging. This confirmed the qRT-PCR results and proved that postovulatory oocyte aging may affect the poly(A)-tail length of maternal-effect genes. Additionally, a significant reduction of trimethylation of histon H3(Lysin 9) was observed in postovulatory aged oocytes. To investigate possible effects of postovulatory oocyte aging on their development to the 2-cell embryos after fertilization, IVF studies were conducted. No differences in the relative amount of 2-cell embryos were shown after 4, 6 or 8 hours postovulatory oocyte aging compared to control oocytes. However, a significant increase of sperms in the perivitelline space of 2-cell embryos after 8 hours postovulatory aging was observed, which indicated an altered structure of the zona pellucida after postovulatory aging. Analysis of zygotic genome activation (ZGA) was examined in 2-cell embryos after fertilization of postovulatory aged oocytes. After 4 hours postovulatory aging an increase in ZGA was observed in the resulting 2-cell embryo, whereas after 6 and 8 hours postovulatory aging ZGA significantly decreased in the 2-cell embryos. In summary, it was shown that postovulatory aging strongly affects molecular parameters in the oocyte and the resulting 2-cell embryo and could have major implications of further development of the embryo.

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Dankert, Debora: Auswirkung einer postovulatorischen Alterung auf molekulare Parameter und die Entwicklungskompetenz muriner Oozyten. 2016.

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