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Untersuchungen zur Regulation und Bedeutung der Serinprotease HTRA1 in Tumorzellen

Ripkens, Kamilla

Die HtrA-Proteine (high temperature requirement A) gehören zu einer Familie von hochkonservierten Serin-Proteasen, die sowohl Mitglieder in Prokaryonten als auch in Eukaryonten aufweisen. Die Genexpression und Funktionen der beiden humanen Proteasen HTRA1 und HTRA3 sind in Verbindung mit mehreren Tumorarten gebracht worden. Dabei findet häufig eine Herunterregulation der Genexpression von HTRA1 oder HTRA3 statt, welche zum Teil über epigenetische Mechanismen vermittelt wird. Funktionell werden der HTRA1-Protease tumorsuppressive Eigenschaften zugesprochen, da das Fehlen von HTRA1 u.a. zu einer erhöhten Zellmigration, einem gesteigerten Zellüberleben und einer Resistenz gegenüber Chemotherapeutika führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels Chromatin-Immunpräzipitationen in den HCT116-Kolonkarzinomzellen das DNA-methyl-bindende Protein MBD2 als Mediator für epigenetisches Silencing der HTRA1-Genexpression identifiziert. Zudem weist der HTRA1-Promoter in diesen Tumorzellen eine geringe Acetylierung von Lysin9 am Histon H3, einem Marker für transkriptionell aktives Chromatin, auf. Diese Ergebnisse korrelieren zum einen mit der verringerten HTRA1-Genexpression und zum anderen mit der potentiellen CpG-Insel und DNA-Hypermethylierung am HTRA1-Promotor. Anhand dieser Ergebnisse kann die Hypothese aufgestellt werden, dass primär die Bindung von MBD2 an hypermethylierte Bereiche der Transkriptionsstartstelle von HTRA1 für die reprimierte Genexpression verantwortlich ist. Desweiteren wurde über in silico-Analysen am HTRA2- und HTRA3-Promotor jeweils eine potentielle CpG-Insel identifiziert. Wobei der HTRA2-Promotor weder in den HCT116- noch in den SW480-Kolonkarzinomzellen einer DNA-Methylierung unterliegt, weist der HTRA3-Promotor in den HCT116-Zellen eine starke Methylierung auf. Der Grad der DNA-Methylierung korreliert bei beiden Genen mit der über qPCR quantifizierten Genexpression. Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob MBD2 für die verringerte Genexpression von HTRA3 in den HCT116-Zellen verantwortlich ist. Es ist davon auszugehen, dass weitere MBD-Proteine oder auch posttranslationale Histonmodifikationen für die Regulation der HTRA3-Genexpression eine Rolle spielen. Zusätzlich wurde in einem weiteren Tumorgewebe die HTRA1-Genexpression untersucht. Es wurde in mehreren primären humanen Melanom-Zelllinien eine heterogene Genexpression von HTRA1 gezeigt, jedoch lassen die durchgeführten Methylierungs-Analysen keine Regulation über eine erhöhte DNA-Methylierung erkennen. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass die Regulation der Genexpression von HTRA1 in verschiedenen Tumorgeweben unterschiedlichen Mechanismen unterliegen kann. Daher sollte in Zukunft geklärt werden, ob in den Melanomzellen eher chromosomale Veränderungen im HTRA1-Gen eine Rolle für die Genregulation spielen. Mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie wurde die zelluläre Verteilung von HTRA1 in den Melanomzellen untersucht. Hierbei waren zum einen eine überwiegend intrazelluläre Lokalisation und zum anderen eine vom Genotyp der Melanomzellen abhängige Verteilung von HTRA1 zu erkennen. In den WT-Melanomzellen war HTRA1 als eine faserartige Struktur zu erkennen. Die konstitutive Aktivierung der ERK-Signalkaskade über mutiertes NRAS bzw. BRAF scheint hingegen eine vesikelartige Lokalisation von HTRA1 zu begünstigen. Desweiteren konnte in den Melanomzellen eine Protein-Protein-Interaktion zwischen HTRA1 und BRAF nachgewiesen werden. Mithilfe von in vitro GST-Pulldown Assays wurde eine Bindung von HTRA1 sowohl an die Ras-Bindedomäne als auch an die Kinase-Domäne von CRAF bzw. BRAF gezeigt und über Immunpräzipitationen und konfokaler Lasermikroskopie wurde die Interaktion zwischen endogenem HTRA1 und BRAF in den Melanomzellen bestätigt. Die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion konnte in dieser Arbeit nicht bestimmt werden. Die zahlreichen Phosphorylierungsstellen an BRAF lassen jedoch die Vermutung zu, dass posttranslationale Modifikationen bei der Bindung eine Rolle spielen. Außerdem wurde die RAS-Bindedomäne als ein in vitro-Substrat für HTRA1 identifiziert. Daher sollte geklärt werden, ob BRAF auch in vivo ein Substrat für HTRA1 darstellt. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Proliferationsexperimenten konnten weitere Hinweise auf funktionelle Eigenschaften von HTRA1 gewonnen werden. So scheint HTRA1 zum einen eine Rolle bei der Chromosomenamplifikation zu spielen. Die Behandlung der Melanomzellen mit einem RAF- bzw. MEK-Inhibitor lässt desweiteren die Vermutung zu, dass die Sensitivität gegenüber pharmakologischen Inhibitoren der ERK-Signalkaskade über die HTRA1-Menge beeinflusst werden könnte. In dieser Arbeit wurden Melanom-Einzelzellklone generiert, welche sich in ihrem BRAF bzw. NRAS Genotyp und in ihrer HTRA1-Menge unterschieden. Die Generierung und zellbiologische Charakterisierung der Einzelzellklone stellt eine wichtige Grundlage für weiterführende Experimente dar. Mit Hilfe dieser primären Melanomzellen kann in Zukunft der Frage weiter nachgegangen werden, welche Rolle HTRA1 in der Tumorprogression spielt. Hierbei steht insbesondere die Beteiligung von HTRA1 im ERK-Signalweg im Vordergrund.

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Ripkens, Kamilla: Untersuchungen zur Regulation und Bedeutung der Serinprotease HTRA1 in Tumorzellen. 2016.

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