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HOXB4-vermittelte Spezifikation des hämogenen Endothels während der Differenzierung pluripotenter Stammzellen, in vitro

Teichweyde, Nadine Jana

Die Identifizierung molekularer Mechanismen, die während der in vitro Differenzierung pluripotenter Stammzellen das hämatopoetische Zellschicksal regulieren, ist Voraussetzung für eine gerichtete und effiziente Generierung hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) und deren künftigen Einsatz im Rahmen der somatischen Gen- und Zelltherapie. In vitro können bisher HSZ mit Langzeit-Repopulationspotenzial nur dann generiert werden, wenn der Homöodomäne Transkriptionsfaktor (TF) HOXB4 während der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ESZ) der Maus, ektop exprimiert wird. Die „Zielzelle“, in der HOXB4 seine Hämatopoese-fördernde Wirkung während der Differenzierung entfaltet und die zugrunde liegenden Mechanismen seiner Aktivität in dieser Zelle sind bisher unbekannt. Um dieser Frage nachzugehen, wurde HOXB4 konstitutiv oder als Tamoxifen-induzierbares Fusionsprotein mit der hormonbindenden Domäne des Östrogenrezeptors (ERT2) retroviral in verschiedenen Maus ESZ-Linien exprimiert, um dessen Einfluss auf die Schicksalsentscheidungen während der hämatopoetischen Differenzierung zu untersuchen. Um die Wirkung von HOXB4 auf wesentliche „Eckpunkte“ der Entwicklung von definitiven HSZ (dHSZ) im Embryo untersuchen zu können, wurden geeignete Reporter- und knock-out ESZ eingesetzt. Die Spezifikation des Mesoderms wurde mit Hilfe einer BrachyuryGFP/+ ESZ-Linie über die Expression des TF Brachyury (Bry) analysiert. Die Expression und der Anteil von Bry+ mesodermalen Zellen, wurde durch die ektope Expression von HOXB4 nicht beeinflusst. Auch am zeitlich nächsten definierten "Meilenstein" der hämatopoetischen Entwicklung, dem bipotenten Hämangioblasten (Blast-Colony Forming Cell, Bl-CFC), der sich weiter zu strukturellem oder hämogenem Endothel spezifizieren kann, führte HOXB4 zu keiner wesentlichen Änderung der Blastenkolonie-Zahlen. Allerdings vermittelte der TF eine sehr starke Zunahme von hämogenen Endothelzellen (HE) in den Blastenkolonien. Dieses nur transient vorkommende Endothel wandelt sich über den Prozess der Endothelial-to-Hematopoietic Transition (EHT) in dHSZ um. Für diesen Vorgang ist der TF Runx1 (AML1) essentiell. Durch den Einsatz einer Runx1 knock-out ESZ-Linie, die eine Doxyzyklin-induzierbare Runx1 Kodierungssequenz im Genom integriert hat (iRunx1(-/-)), konnte der Einfluss von HOXB4 auf die Entwicklung des HEs detailliert untersucht werden, da ohne Runx1 keine EHT zu dHSZ stattfindet. Ektop exprimiertes HOXB4 führte zu einer über 30-fachen Steigerung der Zahl an Endothel-Kolonien, die immunphänotypisch und funktionell als HE definiert werden konnten. Zur genaueren Untersuchung des Prozesses der EHT wurde eine ESZ-Linie verwendet, die heterozygot Venus als Reportergen unter der Kontrolle des proximalen P2 Promotors von Runx1 exprimiert (Runx1Venus/+). HOXB4 induzierte zwar nicht die initiale basale Expression von Runx1, forcierte aber in einem Teil der HE-Zellen eine Steigerung der Runx1 Expression über einen kritischen Schwellenwert, der für die Transition des hämogenen Endothels zu dHSZ notwendig war. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse den Schluss zu, dass die ektope Expression von HOXB4 in differenzierenden pluripotenten Stammzellen der Maus zu allererst in Hämangioblasten als „molekularer Schalter“ wirkt, indem es die hämatopoetische Spezifikation forciert. Die darauffolgende Steigerung der Expression von Runx1 und dessen synergistisches Zusammenspiel mit HOXB4 führen letztendlich zu einer verstärkten Entstehung und Ausreifung von dHSZ. Falls die Ergebnisse dieser Arbeit auf pluripotente Stammzellen des Menschen übertragbar sind, könnten sie eventuell zur künftigen Entwicklung von transplantierbaren, patientenspezifischen HSZ aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZ) wesentlich beitragen.

Identifying the molecular pathways regulating hematopoietic stem cell (HSC) specification from pluripotent stem cells, in vitro, is an important goal for the development of safe somatic gene and cell therapy. So far, HSCs capable of long-term multilineage reconstitution in mice have only been obtained when the homeodomain transcription factor (TF) HOXB4 was ectopically expressed during pluripotent stem cell differentiation. However, the primary "target" cell of HOXB4 responsible for enhanced hematopoietic development, in vitro, is not yet known. To pin down this cell, we retrovirally expressed HOXB4 or a Tamoxifen-inducible fusion protein containing the hormone-binding domain of the estrogen receptor in different reporter and knock-out mouse embryonic stem cells (ESCs) to investigate its influence on major fate decisions during different stages of hematopoietic specification, in vitro. To follow mesoderm specification, we used an ESC-line containing the CDS for green fluorescent protein (eGFP) integrated into the brachyury gene locus (BryGFP/+). Bry expression can be detected in all nascent and migrating mesoderm. Ectopic expression of HOXB4 did not influence the expression-level of Bry or the proportion of Bry+ cells. Likewise, development of the chronologically next cell-type known to be involved in hematopoietic development, the hemangioblast (blast-colony forming cell, Bl-CFC) a bipotent cell capable of generating both structural and hemogenic endothelial cells was not altered by ectopic HOXB4 expression. However, HOXB4 mediated a strong, significant increase in the number of hemogenic endothelium (HE-) cells, a rare, temporary population of endothelial cells which develop from hemangioblasts. Definitive HSCs (dHSCs) arise from the HE by a process called endothelial-to-hematopoietic-cell-transition (EHT) which totally depends on the presence of the transcription factor Runx1. Utilizing a Runx1 knock-out ESC-line containing a doxycycline-inducible Runx1 coding sequence (iRunx1(-/-)), we were able to investigate the influence of HOXB4 on the formation of the HE as dHSCs are not generated without Runx1. Ectopic HOXB4 expression mediated an approximately 30-fold increase in the number of circular endothelial sheets which immunphenotypically and functionally were proven to possess HE characteristics. To be able to follow the process of EHT in more detail, we employed ESCs containing a Venus gene reporter under the control of the proximal P2 promoter of one Runx1 allele (Runx1Venus/+). Although HOXB4 did not induce initial Runx1 expression, it did promote the appearance of a subpopulation expressing increased levels of Runx1 required for the transition of HE-cells towards dHSCs. Taken together, our results strongly suggest that HOXB4 behaves as a “molecular switch” within the hemangioblast by enforcing its hematopoietic specification. The subsequent further increase of basal Runx1 expression and its synergistic activity with HOXB4 leads to the enhanced development and maturation of dHSCs. My results may hold promise to overcome the current limitations in generating transplantable HSCs from human pluripotent stem cells, such as iPSCs.

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Teichweyde, Nadine Jana: HOXB4-vermittelte Spezifikation des hämogenen Endothels während der Differenzierung pluripotenter Stammzellen, in vitro. 2015.

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