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Regulation and function of acid sphingomyelinase (ASM)/ceramide pathway in irradiation-induced cell death

Sharma, Deepa

Zusammenfassung Die Behandlung des malignen Glioblastoms mit einer Kombination aus Strahlen- und Chemotherapie ist eine der vielversprechendsten Behandlungsmöglichkeiten. Die hier vorgelegte Doktorarbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen, die der strahleninduzierten Aktivierung der ASM und der Produktion von Ceramid in Glioblastomen zugrunde liegen. Der Fokus liegt dabei auf dem initialen Ereignis, dass die Aktivierung der Asm und die Produktion von Ceramid in humanen Glioblastom-Zellen einschließt. Die Bestrahlung von humanen Glioblastom-Zellen führt zur schnellen Aktivierung und Translokation der Asm zur Plasmamembran, was zum Clustering von Ceramid und zur Bildung von Ceramid-reichen Membranplattformen führt. Die vorliegende Arbeit untersucht den Mechanismus der ASM-Aktivierung und zeigt, dass dieser von der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies abhängt. Es ist bereits bekannt, dass Ceramid-reiche Membranplattformen aktiv Signalmoleküle akkumulieren, wie beispielsweise die Rezeptoren CD95 und CD40 (Cremesti et al 2001, Grassmé et al 2001a, Grassmé et al 2001b, Grassmé et al 2002a) oder Superoxid-generierende Moleküle wie die NADPH Oxidase bzw deren Untereinheiten gp91phox und p47phox (Bao et al 2010, Zhang et al 2007). Im Einklang mit diesen Beobachtungen zeigt die hier vorliegende Arbeit, dass gp91phox nach Bestrahlung in Ceramid-reichen Membranplattformen eingelagert wird, und dass die Inhibition von gp91 eine weitere ASM-Aktivierung verhindert. Diese Ergebnisse gehen konform mit den Erkenntnissen von Zhang und Kollegen, die zeigen konnten, dass Sauerstoffradikale, die von der NADPH-Oxidase generiert werden, die Asm in einem positiven Rückkopplungsmechanismus beeinflussen (Zhang et al 2008). Schließlich konnten mittels LC-MS/MS verschiedene Interaktionspartner der ASM, von Ceramid und von lipid rafts identifiziert werden: Flotillin-1 und Caveolin-1 wurden in bestrahlten Proben identifiziert, was nahelegt, dass die ASM nach Translokation zur Plasmamembran in Ceramid-reichen Membrandomänen lokalisiert ist Darüber hinaus konnten noch weitere Proteine in den lipid rafts von bestrahlten Zellen identifiziert werden. Dazu zählten unter anderem auch Dysferlin und Sortilin, deren Rolle beim Transport der ASM vom Lyososom zur Plasmamembran bereits für verschiedene Stimuli beschrieben wurde (Han et al 2012, Jin et al 2008b), jedoch bislang nicht für die Translokation nach der Bestrahlung.

Summary: Treating malignant glioblastoma with radiation therapy in combination with chemotherapy is one of the most promising outcomes. The present study aimed to elucidate the underlying mechanism of IR induced activation of ASM and production of ceramide in glioblastoma. We focused on the initial event that involves the activation of ASM and production of ceramide upon irradiation in human glioblastoma cells. Irradiation of human glioblastoma cells resulted in rapid activation and translocation of ASM to plasma membrane which resulted in clustering of ceramide and formation of ceramide-enriched membrane platforms. We addressed the mechanism of ASM activation which was found to be dependent on reactive oxygen species (ROS) production. Ceramide enriched-membrane platforms are known to actively cluster signaling molecule including death receptors CD95 and CD40 (Cremesti et al 2001, Grassmé et al 2001a, Grassmé et al 2001b, Grassmé et al 2002a) or subunits of NADPH oxidase like gp91phox and p47phox (Bao et al 2010, Zhang et al 2007). Similar to these observations we found that upon irradiation gp91phox clustered in ceramide enriched-membrane platforms and further using gp91phox siRNA, inhibition in IR-induced activation of ASM was seen. This result relates to the finding from Zhang and colleagues showing NADPH oxidase-derived ROS regulate Asm-initiated redox signaling in a positive feedback manner (Zhang et al 2008). Lastly we identified various interacting partners of ASM, ceramide and lipid rafts using LC-MS/MS technique. Flotillin-1 and caveolin-1 proteins were identified in irradiated samples which suggest that upon irradiation, ASM translocated to plasma membrane leads to generation of ceramide and further co-localization of ASM and ceramide in lipid raft platforms takes place. Various other proteins were identified in irradiated samples of lipid rafts including dysferlin and sortilin whose role in ASM trafficking from lysosome to plasma membrane has already been described earlier upon different stimuli other than radiation (Han et al 2012, Jin et al 2008b).

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Sharma, Deepa: Regulation and function of acid sphingomyelinase (ASM)/ceramide pathway in irradiation-induced cell death. 2015.

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