Etablierung eines Herstellungsprozesses für die ex vivo Expansion autologer HPV-spezifischer Lymphozyten unter GMP-Bedingungen

Luckau, Stefanie

Die erfolgreiche Behandlung von Tumoren ist eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin. Die Nebenwirkungen der etablierten Behandlungsmethoden Radio- und Chemotherapie sind für die Patienten häufig eine große Belastung. Bei soliden Tumoren, wie den Kopf-Hals-Tumoren (HNSCC, Head and Neck Squamous Cell Carcinoma), bleibt noch die operative Entfernung, bei der allerdings einzelne Tumorzellen im Körper zurückbleiben können. Hier besteht die dringende Notwendigkeit, zielgerichtete Therapien zu entwickeln, da die HNSCC seit einigen Jahren die sechst häufigste Krebserkrankung darstellen und die Überlebensraten seit 15 Jahren stagnieren. Im Fall der HNSCC bietet sich eine gute Möglichkeit für zielgerichtete Therapien, da ein Teil der HNSCC viral durch humane Papillomaviren (HPV) verursacht wird. Im Zuge der Infektion durch HPV werden die Onkogene E6 und E7 in das humane Genom der Wirtszellen integriert, sodass sich bei Patienten mit HPV-positiven HNSCC ein exklusiv auf den Tumorzellen vorkommender Marker finden lässt. Der vorherrschende HPV Typ in HPV-positiven HNSCC ist der Hochrisiko-Typ 16. Damit ist die Entwicklung einer zellulären Immuntherapie basierend auf HPV 16 E6 und E7-spezifischen T-Zellen naheliegend. Der kritische Schritt hierfür ist die ex vivo Expansion der Zellen, die bisher noch nicht unter GMP-konformen Bedingungen gelungen ist. Dies zu ändern war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit. Auf Grund von limitiertem Material von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren wurden die Experimente der vorliegenden Arbeit mit mononukleären Zellen aus peripherem Blut gesunder Spender durchgeführt. Um die Spezifität und Funktionalität der Immunzellen ex vivo und nach Expansion zu vergleichen, wurde zunächst eine Plattform zur Untersuchung HPV 16-spezifischer Reaktionen etabliert. Hierfür habe ich ein ELISpot-Protokoll für die Detektion von IFN-γ, IL-10, Granzym B und Perforin, sowie den Zytotoxizitätstest DELFIA® EuTDA zur Messung T-Zellvermittelter Toxizität optimiert. In den ELISpot-Assays zeigte sich, dass HPV 16-spezifische Reaktionen der Immunzellen gesunder Spender ohne HPV-Impfung sehr schwach waren (Frequenz der normierten medianen Spotzahlen nach Stimulation mit HPV 16 E6, bzw. E7, Frauen und Männer zusammengefasst: IFN-γ - 0,002 %, 0,0 %; IL-10 - 0,2 %, 0,07 %; Granzym B - 0,001 %, 0,004 %; Perforin - 0,001 %, 0,0 %). Wir stellten uns die Frage, ob bei gesunden Personen, die gegen HPV geimpft sind, mehr HPV 16-spezifische Zellen zu finden sind als bei ungeimpften Personen. Im Rahmen der Studie "Immunität gegenüber humanem Papillomavirus (HPV) bei geimpften und ungeimpften Probanden" konnte gezeigt werden, dass die Immunantworten sowohl bei ungeimpften als auch bei geimpften Probandinnen und Probanden sehr individuelle Ergebnisse ergaben. Interessanterweise fiel das Sekretionsprofil der geimpften Probandinnen ebenfalls schwach, wenngleich insgesamt günstiger aus (IFN-γ - 0,002 %, 0,002 %; IL-10 - 0,02 %, 0,004 %; Granzym B - 0,004 %, 0,005 %; Perforin - 0,01 %, 0,009 %). Besonders zeigten sie eine höhere Frequenz von Zellen, die HPV 16-spezifische Granzym B und Perforin sezernierten. Die geringe Frequenz erschwerte die Testung verschiedener Kulturbedingungen und -zusätze zur Entwicklung eines Expansionsprotokolls für HPV 16-spezifische T-Zellen. Ein CMV-spezifisches Protokoll für eine HPV 16-spezifische Expansion zu übernehmen war hierbei nicht einfach möglich, da sich die Reaktionen CMVpp65-spezifischer Zellen in den Funktionstestungen während des Expansionszeitraums deutlich von denen HPV 16 E6 und E7-spezifischer Zellen unterschieden. Somit blieb nur die Möglichkeit, verschiedene Bedingungen direkt mit HPV 16-spezifischen Zellen zu testen. Publikationen der letzten Jahre weisen darauf hin, dass der Einsatz autologer, aktivierter B-Zellen zur erfolgreichen Expansion HPV 16-spezifischer Zellen beitragen kann. Standardprotokolle zur Aktivierung von B-Zellen sehen die Verwendung entweder von CD40L-transduzierter Mausfibroblasten oder von EBV (Epstein Barr-Virus)-haltigem Überstand der Zell-Linie B95.8 vor. Für die erfolgreiche Entwicklung eines Therapieansatzes ist es jedoch nötig, aktivierte B-Zellen unter GMP-Bedingungen herzustellen. Dies mag in naher Zukunft unter Einsatz von löslichem, entsprechend GMP-konform produziertem CD40L möglich sein. Die Verwendung EBV-transformierter B-LCL eignete sich in meinen Händen nicht für eine Expansion HPV 16-spezifischer T-Zellen. ELISpot Assays zeigten, dass T-Zellen bereits auf die unbeladenen EBV-transformierten B-LCL reagierten, da die Transformation der B-Zellen durch latente Infektion mit EBV-Proteinen erfolgte. Die getesteten GMP-konformen Kulturbedingungen umfassten die Expansion von CD3+CD137+ T-Zellen vs. CD8+CD137+ T-Zellen nach Ko-Stimulation mit HPV 16 E6 und E7 Peptidmixen ohne weitere scaffold Reagenzien. Hier erfolgte keine Expansion der T-Zellen über den Expansionszeitraum hinweg. Ein Einsatz von CD3- und CD28-Antikörper beschichteten MACSiBead Particles ("Beads") als artifizielle APC führte zur Bildung großer Zellklone und 10-fachem (CD3+CD137+ T-Zellen), bzw. 38-fachem (CD8+CD137+ T-Zellen) Anstieg der Zellzahlen, jedoch ließ sich keine Spezifität für HPV 16 in den expandierten Zellen nachweisen. Ein Test verschiedener Verhältnisse von "Beads" zu Zellen bei Kulturen von CD8+CD137+ T-Zellen nach Ko-Stimulation mit HPV 16 E6 und E7 Peptidmixen mit und ohne Entfernung der "Beads" für die Funktionstestungen bestätigte die mögliche Expansion der T-Zellen (bis zu 13-fach) ohne Erhalt der Spezifität für HPV 16 E6 und E7. Außerdem wurde die Expansion von CD8+ T-Zellen nach Einzelstimulation mit HPV 16 E6 oder E7 Peptidmixen mit "Beads" vs. CD3- und CD28-gekoppeltem TransAct Reagent in verschiedenen Konzentrationen als scaffold Reagenzien getestet. Der Zusatz an "Beads" führte hierbei erneut zur Bildung großer Zellklone und bis zu 3,5-fachem Anstieg der Zellzahlen. Die gebildeten Zellklone waren bei Zusatz von TransAct Reagent deutlich kleiner und ebenfalls nicht HPV 16-spezifisch. Somit war es mir im Rahmen der begrenzten Projektzeit leider nicht möglich, optimale Bedingungen für ein GMP-konformes Expansionsprotokoll für HPV 16-spezifische T-Zellen mit Hilfe artifizieller APC zu etablieren.

One of the major challenges in modern medicine is the successful treatment of tumours. Side effects of radiotherapy and chemotherapy are often stressful for patients. Solid tumours like HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) can also be removed by surgery. However, it is questionable whether some tumour cells remain in the body. Therefore there is still the urgent need to develop therapeutic options that are target-orientated. Due to the fact, that HNSCC became the sixth most common cancer worldwide during the last years while surviving rates did not improve the last 15 years, it is especially important for patients bearing HNSCC to develop new therapy options. In case of HNSCC such an opportunity might be provided as a part of the HNSCC is caused by human Papilloma viruses (HPV). A part of the viral genome - including the oncogenes E6 and E7 - is getting integrated into the human genome of the host cell during infection. Hence, on tumour cells of HPV-positive HNSCC a unique marker can be found. The main HPV type to be found in HPV-positive HNSCC is HPV 16. Thus the development of a cellular immunotherapy based on HPV 16 E6 and E7-specific T cells would be appropriate. The critical step for this therapeutic approach is the ex vivo expansion of the cells, which could not be managed under GMP-conditions yet. To change this situation was the main issue of this doctoral thesis. The experiments of my thesis had to be performed with peripheral blood mononuclear cells from healthy donors due to limited material from patients with HNSCC. In the first instance it was important to establish a platform to analyse the HPV 16-specific reaction of immune cells in order to compare the specificity and functionality of the cells ex vivo and after expansion. I optimised a protocol for ELISpot assays to detect the secretion of IFN-γ, IL-10, Granzyme B and Perforin after stimulation with HPV 16 E6 and E7 peptide mixes. Furthermore I established and optimised the DELFIA® EuTDA test to measure T cell-mediated toxicity. With the ELISpot assays it turned out that the HPV 16-specific reaction of immune cells from healthy donors without HPV vaccination was very weak (frequencies of standardised median spot values after stimulation with HPV 16 E6 or E7; men and women combined: IFN-γ - 0.002 %, 0.0 %; IL-10 - 0.2 %, 0.07 %; Granzyme B - 0.001 %; 0.004 %; Perforin - 0.001 %, 0.0 %). The question arose if the HPV 16-specific immunity in healthy, HPV vaccinated persons increased as compared to non-vaccinated ones. Within the study "Immunity against human Papilloma virus (HPV) in vaccinated and non-vaccinated probands" it was visible that the immune response greatly varied, both in non-vaccinated and vaccinated volunteers. Nevertheless, the secretion profile of vaccinated volunteers turned out to be similarly low, but overall more favourable (IFN-γ - 0.002 %, 0.002 %; IL-10 - 0.02 %, 0.004 %; Granzym B - 0.004 %, 0.005 %; Perforin - 0.01 %, 0.009 %). This could especially be seen in the secretion of Granzyme B and Perforin. This low frequency of HPV 16-specific cells made testing different culture conditions and scaffold supplements to develop an optimal expansion protocol for HPV 16-specific T cells quite interminable. It was not possible to use a CMV-specific expansion model as the results of functional tests of CMVpp65-specific immune cells during the expansion period largely differed from the results of HPV 16-specific ones. Therefore the only possibility was to analyse different culture conditions with HPV 16-specific immune cells directly. Publications of the recent years point out that it is possible to expand HPV 16-specific T cells using autologous, activated B cells. To develop a therapeutic approach using such T cells it would be necessary to activate B cells under GMP-conditions, though. Standard protocols to activate B cells use either CD40L-transduced mouse fibroblasts or supernatant from the cell-line B95.8 containing EBV (Epstein Barr-Virus), both being not GMP compliant. Using EBV-transformed B-LCL (B Lymphoblastoid Cell Lines) to expand HPV 16-specific T cells was not suitable in my hands. ELISpot assays showed, that T cells already reacted to unloaded EBV-transformed B-LCL due to the latent infection with EBV proteins during the transformation process. Nonetheless, it might be possible to activate B cells in a GMP compliant manner soon using soluble recombinant CD40L, which had been manufactured appropriately. The GMP-compliant culture conditions I tested to develop a suitable expansion protocol were the following ones: Expansion of CD3+CD137+ T cells vs. CD8+CD137+ T cells after co-stimulation with HPV 16 E6 and E7 peptide mix without further scaffold reagents. In this case no expansion of T cells was measurable. Using MACSiBead particles labelled with CD3- and CD28-antibodies ("Beads") as artificial APC lead to generation of big cell clones and an increase in cell counts up to 10-fold (CD3+CD137+ T cells) and up to 38-fold (CD8+CD137+ T cells), respectively. Different ratios of "Beads" to cells in cultures of CD8+CD137+ T cells after co-stimulation with HPV 16 E6 and E7 peptide mixes with and without "Bead" removal for functional testing verified the possibility of expanding T cells (up to 13-fold) without preservation of the specificity against HPV 16 E6 and E7. Furthermore I tested the expansion of CD8+ T cells after stimulation with HPV 16 E6 or E7 peptide mix using "Beads" vs. CD3- and CD28-labelled TransAct Reagent in different concentrations as scaffold reagents. Addition of "Beads" again led to generation of big cell clones and up to 3.5-fold increase of cell counts. The generated cell clones after addition of TransAct Reagent were smaller and did also not show any HPV 16-specific reaction. Therefore, it was unfortunately not possible to find optimal conditions to expand HPV 16-specific T cells in a GMP compliant manner within this terminated project.

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Luckau, Stefanie: Etablierung eines Herstellungsprozesses für die ex vivo Expansion autologer HPV-spezifischer Lymphozyten unter GMP-Bedingungen. 2015.

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