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Einfluss genetischer Varianten im Aquaporin 5-Promotor-Gen auf Schlüsselmechanismen der Sepsis

Rump, Katharina

Die Sepsis stellt eine der häufigsten Komplikationen auf Intensivstationen dar und die Letalität ist mit 30 bis 50 % noch immer sehr hoch. Intraindividuelle Unterschiede in Krankheitsverlauf und Letalität können durch klassische Risikofaktoren nicht allein erklärt werden, vielmehr scheinen auch genetische Faktoren eine Rolle zu spielen. Da das C-Allel des funktionellen Aquaporin 5 (AQP5) A(-1364)C –Promotorpolymorphismus sowohl mit einer verringerten AQP5-Expression als auch mit einem verbesserten Überleben bei schwerer Sepsis einhergeht, scheint AQP5 ein Schlüsselprotein in der Sepsis darzustellen. Unklar war allerdings über welchen Mechanismus Genotyp, Aquaporinexpression und Letalität der schweren Sepsis miteinander verknüpft sind. Ziel dieser Arbeit war es daher aufzuklären, 1) über welchen Mechanismus der Polymorphismus die AQP5-Expression verändert und 2) wie die AQP5-Expression Mechanismen der Sepsis beeinflusst. Zur Beantwortung der ersten Frage wurde zum einen untersucht, ob der Polymorphismus zu einer unterschiedlichen Transkriptionsfaktorenbindung führt und ob der Polymorphismus das Methylierungsmuster der DNA im Vollblut septischer Patienten beeinflusst. Eine in silico- Analyse ergab, dass die Tanskriptionsfaktoren NMP4, c-Myb und NFAT putative Bindungsstellen um Position -1364 tragen. Mittels Electrophoretic mobility Shift Assays (EMSA) konnte eine spezifische Bindung von NMP4 verifiziert werden. Diese scheint beim C-Allel stärker ausgeprägt zu sein. Reporterassays zeigten jedoch, dass NMP4 die Promotoraktivität des AQP5-Promotors unabhängig vom Genotyp erhöht. Auch die AQP5 mRNA-Expression wurde in HEK293 Zellen signifikant durch NMP4 erhöht, wie Real-Time-PCR-Experimente zeigten. Außerdem konnte eine neue Bindungsstelle für NMP4 in der AQP5-Promotoregion von –nt592/-602 identifiziert werden, die für die starke Erhöhung der AQP5-Promotoraktivität durch NMP4 mitverantwortlich zu sein scheint. Da NMP4 also zwar einen transkriptionellen Regulator der AQP5-Expression darstellt, nicht aber die unterschiedliche AQP5-Expression bei A- und C-Allelträgern bedingt, wurde weiter untersucht, ob der Polymorphismus Einfluss auf das Methylierungsmuster hat. Hierbei konnte im Vollblut von septischen Patienten 4 Positionen (nt-1036, nt-1014, nt-856 und nt-839) detektiert werden, in denen C-Allelträger eine signifikant erhöhte Methylierung aufwiesen. Ob dieser Unterschied tatsächlich für die unterschiedliche AQP5-Expression verantwortlich ist, konnte abschließend nicht geklärt werden. Dafür spricht aber, dass eine verringerte AQP5-Promotormethylierung mit einer erhöhten AQP5-Expression in Immunzellen einhergeht. Ferner wird die Methylierung von Immunzellen durch LPS vermindert. Dieses führte zu einer verstärkten AQP5-Expression in THP-1 Zellen. Dieses untermauert die Stimulation der Zellen mit LPS, welche demonstrierte, dass die AQP5-Expression in THP-1 Zellen durch LPS verändert wird. Ein weiterer wichtiger Punkt dieser Arbeit war die Frage, ob AQP5 ein Schlüsselprotein in der LPS induzierten Inflammation darstellt. Hierzu wurden AQP5-KO Mäusen sowie deren WT Wurfgeschwistern LPS injiziert und deren Überlebenswahrscheinlichkeit untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass die KO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen eine bessere Überlebensrate aufwiesen. Diese in vivo Daten wurden auch in vitro verifiziert. Ziel war es aufzuklären, wie AQP5 Mechanismen der Sepsis beeinflusst. Zunächst konnte mittels immunologischer Färbung nachgewiesen werden, dass C-Allelträger eine verringerte AQP5-Expression auf neutrophilen Granulozyten aufweisen. Dieses ging mit einer verminderten Migration dieser Zellen einher. In Übereinstimmung damit zeigen AQP5-überexprimierte Jurkat Zellen eine verstärkte Migration im Vergleich zu nativen Zellen. Demgegenüber unterschied sich die Proliferation monozytärer Zellen nicht zwischen den Genotypen. Nachdem wir zeigen konnten, dass die AQP5-Expression mit der Sepsisletalität assoziiert ist, wurde untersucht, ob die LPS induzierte Änderung der AQP5-Expression durch Therapeutika beeinflussbar ist. Hierfür wurden THP-1 Zellen mit LPS und cAMP stimuliert. Die Daten zeigten jedoch, dass cAMP LPS induzierte Effekte nicht aufheben kann. In folgenden Studien bleibt nun zu klären, wie LPS die Signalkaskade der AQP5-Expression und Translokation beeinflusst. Zusammenfassend scheint AQP5 ein Schlüsselprotein in der Sepsis zu sein, indem es die Migration von neutrophilen Granulozyten beeinflusst. Auch die Methylierung am AQP5-Promotor spielt in der Sepsis und möglicherweise auch bei der unterschiedlichen Expression von A- und C-Allelträgern eine Rolle.

Sepsis is one of the most common complications at intensive care units in Germany and lethality remains with 30 – 50 % unbounded high. Wide variability exists regarding the outcome in severe sepsis, which in part may be caused by genetic variations. A potential candidate for such variations is the gene-encoding aquaporin (AQP) 5, which mediates key mechanisms of inflammation that prevail in sepsis, including cell migration and proliferation. In addition the C allele of the functional AQP5 A(-1364)C promotor polymorphism is associated with decreased AQP5 expression but better outcome in severe sepsis. So far the underlying molecular and physiologic alterations linking decreased AQP5 expression to increased 30-day survival have not proven. Therefore the objective of the present thesis is to elucidate 1) the molecular mechanisms which facilitate the different AQP5 expression in A- und C genotypes and 2) the underlying mechanism of how AQP5 expression affects sepsis survival. Binding of transcription factors to the direct promoter region of the polymorphism and AQP5 promoter methylation of septic patients are analyzed in order to answer the first question. In silico analysis reveals NMP4, c-Myb and NFAT as putative transcription factor candidates. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) confirm specific binding of NMP4 to the promotor region of nt-1364, thereby binding to the C- allele appears to be stronger. In contrast to this, reporter assays show increased promotor activity of all analyzed promoter constructs irrespective of genotype. In addition real-time-PCR shows increased AQP5 expression after NMP4 overexpression in HEK293 cells. Furthermore an additional NMP4 binding site can be identified in the AQP5 promoter at position –nt592/-602. Epigenetic regulation by DNA methylation is considered as a second possible mechanism. This is investigated in whole blood samples of septic patients. Four positions with increased methylation in C-allele patients can be detected (nt-1036, nt-1014, nt-856 and nt-839). The influence of decreased methylation in these specific positons on AQP5 expression cannot be elucidated. But it can be shown that decreased AQP5 promoter methylation is associated with increased AQP5 expression in immune cells. Therefore the decreased AQP5 expression of C-allele genotypes could be caused by increased methylation of these positions. Furthermore Lipopolysaccharide (LPS) alters AQP5 promoter methylation. This can be demonstrated in a monocytic cell line, which was stimulated with LPS. The second part of this thesis is to investigate the mechanisms of AQP5 protein expression on key mechanisms of sepsis. First of all we investigate the survival of AQP5-Knockout (KO) mice and wildtyp mice after LPS induced inflammation. AQP5-KO mice show significantly increased survival compared to wildtyp mice. These data are verified in vitro. It is investigated if AQP5 expression influences immune cell migration or proliferation. It can be demonstrated that neutrophil granulocytes from AA-genotypes have increased AQP5 expression and show increased neutrophil migration compared to AC/CC-genotypes. In addition AQP5 overexpression increases migration in the lymphocytic cell line Jurkat. In contrast proliferation of monocytic cells does not differ between genotypes. Finally, we investigate if the downstream effector of the β2 adrenergic signaling pathway cAMP is a therapeutic option in sepsis treatment. cAMP does not abolish LPS induced effects on AQP5 expression or morphology of THP-1 cells. Therefore β2 adrenergic stimulation is not a therapeutic option in sepsis treatment. Summarizing AQP5 seems to be a key mediator in sepsis as AQP5 expression modulates sepsis survival and migration of neutrophil granulocytes. In addition, a novel transcriptional regulator of AQP5 expression can be identified as NMP4. Its role in sepsis has to be analyzed by prospective studies. One important regulatory mechanism of AQP5 expression in sepsis might be AQP5 promoter methylation.

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Rump, Katharina: Einfluss genetischer Varianten im Aquaporin 5-Promotor-Gen auf Schlüsselmechanismen der Sepsis. 2015.

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