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Reprogrammierung von somatischen Zellen des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) in den pluripotenten Status

Zuk, Melanie Claudia

Da iPS Zellen in jeden Zell- oder Gewebetyp differenziert werden können, der für eine autologe Transplantation benötigt wird, wären induzierte pluripotente Stammzellen in der regenerativen Medizin von großem Nutzen. Daher ist es sinnvoll, zur Erforschung der Generierung (und späteren Differenzierung) von iPS Zellen Tiermodelle einzusetzen, die näher mit dem Menschen verwandt sind als das üblicherweise verwendete Mausmodell. Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, adulte Hautfibroblasten des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) in iPS Zellen zu überführen. Da zu Beginn der Forschungsarbeiten keine Veröffentlichungen zur Reprogrammierung von Callithrix jacchus Zellen vorlagen, wurden die verwendeten Methoden aus etablierten Praktiken in der Forschung an Menschen- und Mauszellen abgeleitet und dem Affenmodell angepasst. Dabei wurden unterschiedliche lentivirale Methoden und Reprogrammierungs-bedingungen getestet. Die Zellen wurden einerseits mit einem polycistronischen Vek-tor, der die cDNA der humanen Yamanaka-Faktoren OCT4, KLF4, SOX2 und MYC koexprimierte, transduziert. Andererseits wurde der Reprogrammierungsprozess mit separaten Vektoren initiiert, mit Hilfe derer die genannten Faktoren einzeln in die Zelle eingebracht wurden. Weitere Ansätze wurden unter Hinzunahme eines LIN28A-Expressionsvektors durchgeführt. Zur Unterstützung des Reprogrammierungspro-zesses wurden sogenannte Small Molecules zu den Zellen gegeben, die epigenetische Blockaden beseitigen oder Signaltransduktionswege aktivieren oder inhibieren. Allerdings konnten nur partiell reprogrammierte Zellen (piPS) generiert werden, die auch durch die Verwendung von Small Molecules nicht in vollständige iPS Zellen über-führt werden konnten. Die generierten Kolonien zeigten allerdings Charakteristika pluripotenter Zellen. So exprimierten sie die Alkalische Phosphatase und wurden positiv auf SSEA3- und SSEA4-exprimierende Zellen getestet. Dabei exprimierten aber nur wenige Zellen die Marker TRA-1-81 oder TRA-1-60. Die Analyse der endogenen pluripotenzassoziierten Transkripte in den piPS Zellen mittels qRT-PCR zeigte hingegen, dass diese Gene auf ein höheres Level als in den Fibroblasten induziert wurden. Allerdings wurde je nach Methode nur eine mit ES Zellen vergleichbare Expression von SOX2, MYC und ZFP24 oder KLF4 gemessen; die Hochregulation von POU5F1 war dabei stets unzureichend. Zudem wurde der retrovirale Vektor in den piPS Zellen nicht stillgelegt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die auf einer globalen Transkriptomanalyse aufbaut, zeigte, dass die piPS Zellen eine miteinander vergleichbare Genexpression aufwiesen. Im Vergleich zu ES Zellen zeigten sie zwar deutliche Unterschiede, ihre Transkriptome waren diesen aber ähnlicher als denen der Hautfibroblasten. Auch wenn die somatischen Weißbüschelaffenzellen nicht vollständig reprogrammiert werden konnten, können die generierten piPS Zellen für die Identifizierung transkriptioneller und epigenetischer Veränderung sowie aktiver und inhibierter Signalt-ransduktionswege während der unterschiedlichen Stadien des Reprogrammierungsprozesses eingesetzt werden. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnte in weiteren Forschungen versucht werden, Keratinozyten mit sechs Faktoren auf separaten Vektoren zu transduzieren. Die epithelialen Zellen könnten möglicherweise effizienter reprogrammiert werden, da sie die MET nicht durchlaufen. Auch wenn der polycistronische Vektor zu besseren Reprogrammierungsergebnissen führte, können mit separaten Vektoren mehr als vier Faktoren in die Zellen transduziert werden.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are attractive for regenerative medicine because they can be differentiated towards any somatic cell type and tissues needed for autolo-gous transplantation. It would be desirable to test the medical applicability of this notion in a relevant animal model system which is more closely related to humans than the commonly used mouse model is. Thus the non-human primate common marmoset (Callithrix jacchus) is a suitable choice. The major aim of this thesis was to reprogram dermal fibroblasts of the marmoset monkey towards iPSCs. Because the conditions for reprogramming marmoset cells were illdefined at the beginning of this research project, different lentiviral approaches and reprogramming conditions were used. Thus the somatic cells were transduced with a polycistronic vector, co-expressing the cDNAs for human OCT4, KLF4, SOX2 and MYC (Yamanaka factors). Furthermore the reprogramming process was initiated with separate vectors, each coding a Yamanaka factor together with a different fluorescence protein. In further approaches these were additionally combined with a LIN28A-expression vector. To overcome possible epigenetic roadblocks due to remaining DNA-methylation or to activate or inhibit signaling trans-duction pathways, which are supportive for pluripotency, small molecules were added to the cells. However, the marmoset skin fibroblasts could not be fully reprogrammed with all the different approaches. Even the use of various small molecules did not yield to fully reprogrammed cells. Indeed the obtained colonies showed some hallmarks of pluripotency. They expressed alkaline phosphatase and stained positive for the pluripotency markers SSEA3 and SSEA4, but they were mostly negative for TRA-1-81 and TRA-1-60 expression. Analysis of endogenous pluripotency associated gene transcription by qRT-PCR showed that these genes were significantly induced above levels of unmanipulated fibroblasts. However, depending on the approach, only SOX2, MYC and ZFP24 or KLF4 expression was comparable between the partial iPSCs (piPSCs) and marmoset embryonic stem cells (ESC). Beyond that especially the up regulation of POU5F1 expression was insufficient. Noteworthy, they also failed to silence retroviral vector expression, a phenomenon normally observed during successful pluripotency induction in human and mouse cells. Furthermore, global transcriptome measurements by RNA-seq and subsequent principle component analysis (PCA) revealed that the generated piPS cells showed comparable gene expression among each other but still different from marmoset ESCs. However, they were much more similar to the ESCs than to the skin fibroblasts indicating their partially reprogrammed state. Thus piPSCs are not fully reprogrammed they are very powerful to identify transcrip-tional and epigenetic changes as well as active and inhibited signal transduction path-ways during the different stages of the reprogramming process. However, the findings of the piPSC analyses will certainly help to find better ways for an efficient and complete reprogramming of somatic marmoset cells. One could consider transducing kerationcytes with six factors on six separate vectors. The epithelial cells could possibly be reprogrammed more efficiently, because they do not have to pass the MET. Alt-hough the polycistronic vector led to better results, only separate vectors are suitable to transduce cells with more than four factors.

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Zuk, Melanie Claudia: Reprogrammierung von somatischen Zellen des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) in den pluripotenten Status. 2015.

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