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Hochentwickelte Aminopyrazol-Hybride gegen pathologische Prozesse der Alzheimer-Krankheit

Hellmert, Marco

Verschiedene Aminopyrazol-Trimer-Derivate wurden bereits in ihrer Aktivität gegen die Aggregation des Abeta-Peptids untersucht, jedoch wurden die Inhibierungsexperimente oftmals mit einem Überschuss an Ligand durchgeführt. In dieser Arbeit wurde überprüft, ob ebenfalls substöchiometrische Wirkungsweisen vorhanden sind. Hierbei konnten die drei Hybride Trimer-D3 43, Trimer-TEG-TEG-D1 42 und Trimer-Diamin 40 erfolgreich untersucht werden. Dosis-Wirkungsbeziehungen ergaben IC50-Werte von 2.2 µM für Trimer-D3 43 und für 6.3 µM Trimer-TEG-TEG-D1 42, welche unterhalb der eingesetzten Abeta-Konzentration von 10 µM liegen. Die Konformationsänderung des Abeta-Peptids durch Inkubation mit 50mol% an Liganden wurde mittels CD-Spektroskopie untersucht. Durch den Einfluss der Liganden zeigte sich im Verlauf der Zeit eine Abschwächung der für das Abeta-Peptid charakteristischen negativen Bande bei 218 nm und dazu konnte ein positiver Cotton-Effekt zwischen 260 und 320 nm beobachtet werden, was auf eine Wechselwirkung des Liganden mit der KLVFF-Sequenz des Abeta-Peptids zurückzuführen ist. Mit den beiden wasserlöslichen Verbindungen Trimer-D3 43 und Trimer-TEG-TEG-D1 42 wurden PICUP-Experimente durchgeführt. Hierbei konnte festgestellt werden, dass Trimer-D3 43 keine signifikanten Effekte auf die oligomere Größenverteilung zeigte. Ein kleiner Effekt konnte nur in der Bildung von Tetrameren beobachtet werden. Trimer-TEG-TEG-D1 42 hingegen beeinflusste die Größenverteilung in höherem Maße. Monomere wurden mit dem Liganden bevorzugt stabilisiert, wohingegen höhere Oligomere nicht gebildet wurden. TEM-Experimente gaben Aufschluss über die Morphologieänderung des Abeta-Peptids durch Einfluss substöchiometrischer Mengen an Ligand. Für Abeta(1-42) als Referenz konnte ein Fibrillennetzwerk beobachtet werden. Die Inkubation mit den Liganden führte zu kleineren Agglomeraten anderer Morphologie. Ebenfalls zeigten TEM-Aufnahmen der Liganden ohne Abeta(1-42) morphologisch andere Zusammenschlüsse, welche nicht mit der Referenz und den resultierenden In-hibierungsversuchen der Liganden mit dem Abeta-Peptid zu vergleichen waren. Für die nicht kovalente Bindung eines Trimer-Derivates mit einem Abeta-spezifischen Antikörper konnte in der Arbeit von März-Berberich keine ausreichend starke Verknüpfung über Ni2+-Ionen erzielt werden, wobei als Grund auf die mono-NTA-Einheit hingewiesen wurde. Basierend darauf war das Ziel in dieser Arbeit die Synthese einer Trimer-Hybrid-Verbindung, welche über eine Tris-NTA-Einheit verfügt und somit die nicht kovalente Bindung zum Antikörper verstärkt. Nach der erfolgreichen Synthese von Trimer-tris(NTA)-Cyclam 62 über 15 Stufen konnte im Arbeitskreis Korth via nativer Gelelektrophorese gezeigt werden, dass der Trimer-tris(NTA)cyclam-IC16scFv Komplex eine thermodynamische Stabilität aufweist. Des Weiteren konnten über ELISA starke Affinitäten des Hybrid-Komplexes sowohl mit dem IC16-scFv- als auch VHH-E4-Antikörper gegenüber Abeta festgestellt werden, wobei die einzelnen Substanzen nur schwache bis gar keine Affinitäten zeigten. Da eine Stabilität des Komplexes und eine Affinitätserhöhung mit dem Abeta-Peptid gezeigt wurden, könnte in zukünftigen Arbeiten überprüft werden, ob dieser Komplex ebenfalls die Aggregation von Abeta beeinflusst. Die Verwendung von ThT-Assays zur Überprüfung der Fibrillenbildung, CD-Spektroskopie für Konformationsänderungen, TEM-Messungen für die Visualisierung und analytische Ultrazentrifugation zur Bestimmung der Bindungskonstante und Ermittlung der Wechselwirkung mit Abeta-Oligomeren könnten weiteren Aufschluss über die Effizienz des Hybrid-Komplexes geben. Die Herstellung künstlicher Proteasen zur Peptidspaltung findet immer mehr Bedeutung im Bereich der pathogenen Proteinaggregation. Eine potentielle wasserlösliche Protease-Einheit ist der CoIII-Cyclen-Komplex, welcher in dieser Arbeit mit dem Aminopyrazol-Trimer als Erkennungseinheit für Abeta funktionalisiert wurde. Es wurden mehrere Synthesestrategien erarbeitet, die ebenfalls die C- und N-terminale Funktionalisierung des Trimers einschloss. Das Aminopyrazoltrimer konnte N-terminal erfolgreich über einen Dodecyl-Spacer mit dem Cyclen verknüpft werden. Jedoch konnten keine Proteolyse-Experimente durchgeführt werden, da die Substanz für die Metallkomplex-Bildung nicht im wässrigen Medium löslich war. Da die Aminopyrazol-Einheit hydrophob und der CoIII-Cyclen-Komplex wasserlöslich ist, könnte in zukünftigen Arbeiten der Fokus auf wasserlösliche Spacer gelegt werden, um die Hydrophilie des Trimer-Cyclen-Hybrids zu gewährleisten. Der Einfluss von Trimer-D3 43 auf die Sekretion des Amyloid Precursor Proteins (APP) wurde in unterschiedlichen biologischen Tests untersucht. In Western Blots konnte nachgewiesen werden, dass Trimer-D3-Lys 45, welches nach Crosslinking mit NHS-Sepharose immobilisiert wurde, in der Lage ist APP zu binden. Im Folgen-den wurde überprüft, ob sich dadurch die Sekretion von APP verändert. Die Sekretion von APP lieferte in Anwesenheit von Trimer-D3 43 überraschend C-terminale APP-Fragmente (APP-CTF), deren Größe sich von der unterscheidet, die durch alpha-, beta- oder gamma-Sekretase gebildet wird. Der Einsatz beider Einzelkomponenten (AP + D3) hatte dagegen keinen Einfluss auf die APP-Sekretion. Im Einzeltest wurde bestätigt, dass Trimer-D3 43 im Gegensatz zu dem bekannten gamma-Sekretase-Inhibitor LY-411575 tatsächlich keinen Einfluss auf die gamma-Sekretase ausübt. Über die Identifizierung der Schnittstelle im APP wurde die mögliche Bildung von theta-CTFs überprüft (Beeinflussung von BACE2). Der CT15-Antikörper, welcher die Abeta(10-23)-Sequenz erkennt, konnte auch das vom Aminopyrazol-D3-Hybrid induzierte APP-CTF binden; das kleinere Epitop Abeta(17-24) von 4G8 reichte dazu jedoch nicht aus. Daraus lässt sich schließen, dass in Gegenwart von Trimer-D3 43 die APP-Prozessierung näher am C-Terminus erfolgt als an der alpha-Sekretase-Spaltungsstelle. Das würde zu einer BACE2-Spaltung zwischen 19 und 20 gut passen. Endgültige Klarheit sollen hier massenspektrometrische Untersuchungen der gebildeten Fragmente ergeben. Für die Funktionalisierung von Calciumphosphatnanopartikeln mit fluoreszenzgela-belten Aminopyrazol-Hybriden konnten zwei Derivate über SPPS und anschließende Kupplung der Trimer-Säure 57 durch manuelle Peptidfestphasensynthese synthetisiert werden. Hierbei wurde mit dem jeweiligen Fluoreszenzlabel am Harz das D3-Peptid 15 an die feste Phase gekuppelt und schließlich mit dem Aminopyrazoltrimer verknüpft. Dabei konnten Trimer-D3-Dansyl 88 und Trimer-D3-Coumarin 89 erhalten werden. Biophysikalische Untersuchungen ergaben eine sehr gute Inhibierungseffizienz in ThT-Assays. Da Trimer-D3 43 durch vorherige Arbeiten als potentieller Inhibitor bekannt war, liegt diese Grundstruktur den erhaltenen Ergebnissen zugrunde. Die erfolgreiche Funktionalisierung der Nanopartikel mit den Chromophoren konnte durch UV/Vis-Quantifizierungen nachgewiesen werden. Die Adsorptionen auf den Nanopartikeln erfolgten in einem Gehaltsbereich zwischen 50 und 100% in Bezug auf die unterschiedlichen Konzentrationen. DLS-, NS- und REM-Messungen zeigten einheitliche Partikeldurchmesser um die 100 nm. MTT-Tests zeigten keine Toxizität gegenüber HeLa-Zellen. Bei fluoreszenzmikroskopischen Transportuntersuchungen mit den Trimer-D3-Dansyl funktionalisierten Nanopartikeln konnte keine Aufnahme in die Zellen beobachtet werden. Die Überprüfung der Aufnahme von Trimer-D3-Dansyl 88 ohne Nanopartikel zeigte zwar fluoreszierende Zellen, jedoch wurde vermutet, dass sich die Hybridsubstanz nur auf den Zelloberflächen anlagert. Hierbei wurden zum Teil toxische Wirkungen der Substanz auf die Zellen ermittelt. Aufgrund der Hydrophobie der gelabelten Hybridverbindungen lag die Toxizität vermutlich am Lösungsmittel DMSO, womit die Hybride zunächst gelöst werden mussten.

Recently, different aminopyrazole derivatives were examined in their activity against the aggregation of the Abeta-peptide. The inhibition experiments were often performed with an excess of ligands, while in this work, substoichiometric effects were also tested. Herein the derivatives Trimer-D3 43, Trimer-TEG-TEG-D1 42 and Trimer-diamine 40 were successfully investigated. Dose-response curves gave IC50 values of 2.2 µM for Trimer-D3 43 and 6.3 µM for Trimer-TEG-TEG-D1 42, which are below the deployed A concentration of 10 µM. Conformational properties of the A peptide with 50mol% amount of ligand were analyzed using CD spectroscopy. By adding different ligands the characteristic negative band at 218 nm of the Abeta peptide decreased in the course of time. Additionally, a positive Cotton effect was observed between 260 and 320 nm, which indicated the interaction of the aminopyrazole trimer unit with the KLVFF sequence of the Abeta peptide. With water soluble compounds Trimer-D3 43 and Trimer-TEG-TEG-D1 42 PICUP experiments were performed. Trimer-D3 43 showed no significant effect on the oligomer distribution. Trimer-TEG-TEG-D1 42 showed the stabilization of monomers, whereas the formation of higher oligomers was not observed. TEM microscopy gave informations about morphologic changes of the aggregates with substoichiometric amounts of the ligands. Abeta(1-42) as reference showed a fibril network. The incubation with ligands led to smaller agglomerates with different morphologies. TEM pictures of the ligands without Abeta showed morphologically different associations, which could not be compared with the reference. In the work of März-Berberich a non covalent binding of the trimer with a His-tagged Abeta-specific antibody via Ni2+ complexation could not be achieved using a mono-NTA unit. So in this work, a trimer-hybrid with a tris(NTA)-cyclam unit was successfully synthesized over 15 steps (compound 62) to guarantee a stronger binding to the antibody. The group of Korth showed that the trimer-tris(NTA)-cyclam-IC16scFv complex had a thermodynamic stability in native PAGE. Furthermore, ELISA experiments determined strong affinities of the hybrid complex to the Abeta peptide with both IC16scFv and the camelide antibody VHH-E4, whereas the single compounds showed no effect on the affinity to Abeta. Prospective studies could be focussed on inhibition experiments like ThT assays for fibril formation, CD spectroscopy for conformational changes, TEM measurements for the visualization and analytic ultracentrifugation to assign the binding constant and the interaction with Abeta oligomers to learn more about the efficiency of the hybrid complex. The synthesis of artificial proteases for peptide cleavage plays more and more an important role in the area of pathogenic protein aggregation. A potential watersoluble protease unit is the CoIII-cyclen complex. This complex successfully was coupled N-terminally with an aminopyrazole trimer using a dodecyl spacer (compound 86). However, the proteolytic experiments could not be managed because of non-solubility of the compound under aqueous conditions. In the future, the protease unit and the aminopyrazole trimer could be coupled over a more watersoluble spacer to ensure proteolytic experiments in water. The influence of Trimer-D3 43 to the secretion of the amyloid precursor protein was examined in biological tests. Western Blots established that Trimer-D3-Lys 45 could bind to APP. Therefore the change of APP secretion was investigated. Surprisingly, in the presence of Trimer-D3 43 C-terminal fragments (CTFs) were formed, which were different to the fragments formed by alpha-, beta- and gamma-secretase. The input of the single compounds (aminopyrazole + D3-peptide) showed no influence on APP secretion. Single tests confirmed that Trimer-D3 43 has no influence on the gamma-secretase compared to the known inhibitor LY-411575. For identification of the cleavage site in APP the formation of theta-CTFs (influence of BACE2) was checked. The CT15-antibody recognizing the Abeta(10-23) sequence could bind the CTF, which is induced by Trimer-D3 43. Therefore, in presence of the aminopyrazole derivative the processing of APP occurred closer to the C-terminus compared to the alpha-secretase cleavage site. For final clarity mass spectrometric measurements could deliver the exact cleavage position. For the functionalization of calciumphosphate nanoparticles with fluorescence labeled aminopyrazole hybrids two derivatives could be successfully generated using automatic and manual solid phase peptide synthesis (Trimer-D3-Dansyl 88 and Trimer-D3-Coumarin 89). Biophysical experiments showed strong inhibition efficiency in ThT-assays. UV/Vis quantifications proved successful functionalization of the nanoparticles with the chromophores. DLS, NS and REM measurements showed consistent particle diameters of about 100 nm. MTT tests indicated no toxicity in HeLa cells. With fluorescencemicroscopic transport analysis the absorption of the fluorescence-labeled nanoparticles could not be observed. The examination of Trimer-D3-Dansyl 88 absorption without nanoparticles showed indeed fluorescent cells, but it is supposed that the compound accumulated on the cell surface. However, toxic effects of the compound to the cells were observed. Because of the hydrophobia of the labeled compound DMSO had to be used as solvent which is probably the most critical component for the observed cell toxicity. Prospective works could use a fluorescein resin[161] to become a more watersoluble Trimer-D3 derivative so that the input of DMSO can be avoided. Nowadays the main objective in medicine is to provide early and exact diagnostics for efficient treatments. Therefore, the focus is set on functionalization of nanoparticles.[162] Single compounds like an aminopyrazole as beta-sheet breaker, a CoIII-cyclen complex as artificial protease and the D3-peptide as well as a His-tagged Abeta-specific antibody coordinated with Ni2+ to tris(NTA)-cyclam as recognition unit could be combined on nanoparticles and lead to a selective aggregation inhibitor for Abeta. The advantage is that the synthesis of smaller molecules, which are combined in the last step, is easier than the covalent composition of different drug classes.

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Hellmert, Marco: Hochentwickelte Aminopyrazol-Hybride gegen pathologische Prozesse der Alzheimer-Krankheit. 2015.

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