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Die Rolle von Trps1 in der Bildung von Transkriptonskomplexen und Chromatinorganisation

Moll, Carina

Bei dem „Tricho-Rhino-Phalangealen Syndrom“ (TRPS) handelt es sich um eine autosomal dominante Erkrankung, die durch craniofaziale und skelettale Missbildungen charakterisiert wird. Die genetische Ursache dieser Erkrankung liegt in verschiedenen Mutationsarten des TRPS1 Gens. Analysen Trps1defizienter Mäuse deuten auf eine Funktion von Trps1 in der Chondrogenese hin. DasTrps1Gen kodiert für ein Multizinkfinger(Zf) -Protein, welches neun Zf-Domänen beinhaltet. Diese vermitteln die Interaktionen mit den Transkriptionsfaktoren Gli3a und Runx2 sowie der Histondeacetylase Hdac4, bei denen es sich um Regulatoren der Chondrozytenproliferation und -differenzierung handelt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Trps1 erstens über die verschiedenen Zinkfingerdomänen als Adaptorprotein für die Bindung zahlreicher Interaktionspartner dient und zweitens ein Bestandteil von Multiproteinkomplexen ist. Zur Aufklärung der Trps1-Funktion wurden Ko-Immunpräzipitationen (Ko-IPs) mit potenziellen Interaktionspartnern durchgeführt. Dabei konnte eine Interaktion zwischen Trps1 und weiteren wichtigen Regulatoren der Chondrogenese wie Mef2c, Sin3a und Sox9 nicht nachgewiesen werden. Das Hitzeschockprotein Hsp90β und die Histondeacetylase Hdac1 dagegen wurden als neue Trps1 -Interaktionspartner identifiziert. Interessanterweise interagierte Trps1 nicht mit Hdac2, obwohl dieses eine 85%igeHomologie zu Hdac1 aufweist und in vielen Prozessen mit redundanter Funktion beschrieben wurde. Mit Hilfe von Deletionskonstrukten wurden die Interaktionsdomänen für Trps1 und Hdac1 eingegrenzt. Dabei ist die Hdac1- Deacetylasedomäne für die Interaktion notwendig. Diese Domäne ist in allen Hdacs vorhanden, in den Trps1-interagierenden Hdacs 1, 4 und 6 konnten jedoch spezifische Sumoylierungsstellen identifiziert werden. Ob die Sumoylierung für die Interaktion von Bedeutung ist, muss in weiteren Experimenten untersucht werden. Für Trps1 konnten die Zf7 - 9 als interaktionsrelevanter Bereich identifiziert werden. Dieser ist für die Interaktion mit weiteren Proteinen, wie beispielsweise Runx2, einem Hauptregulator der Knochenentwicklung, verantwortlich. Da Runx2 ebenfalls mit Hdacs interagiert, wäre die Ausbildung eines gemeinsamen regulatorischen Komplexes möglich. Weitere Hinweise hierfür lieferte die Beobachtung, dass mittels FRET-Analyse keine direkte Protein-Proteininteraktion gezeigt werden konnte. Demzufolge könnten Trps1 und Hdac1 Bestandteile eines Multiproteinkomplexes sein, in dem sie über andere Proteine verknüpft sind. Um diese mögliche Komplexbildung zu untersuchen, wurden Gelfiltrationen durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass Trps1 und seine Interaktionspartner in 500 - 150kDa großen Komplexen vorliegen. Nach Isolation und Aufreinigung konnten Hdac1, Hdac4 und Hsp90β in Trps1-Komplexen >500 kDa nachgewiesen werden. Ob diese Komplexe während der Chondrogenese erhalten bleiben, wurde anhand der chondrogenen ATDC-5 Zelllinie untersucht, die bis zum Stadium von hypertrophen Chondrozyten differenziert wurde. Während der Differenzierung reduzierte sich sowohl die Trps1 -Proteinmenge als auch das Größenspektrum der Trps1- Komplexe. Im Unterschied zu undifferenzierten ATDC-5 Zellen war in differenzierten Zellen eine geringere Menge an Hdac4 vorhanden und konnte nicht mehr mit Trps1 präzipitiert werden. Hdac1 und Hsp90β lagen auch in differenzierten ATDC-5 Zellen in Trps1-Komplexen >500 kDa vor. Aufgrund der kalkulierten Größen müssen jedoch noch weitere, bislang unbekannte oder nicht untersuchte, Trps1- Bindepartner vorliegen, deren Identifikation zum Verständnis der Regulation der enchondralen Ossifikation beitragen kann.

“Tricho-rhino-phalangeal syndrome” (TRPS) is an autosomaldominant inherited human disorder caused by mutations in the TRPS1 gene and is characterized by craniofacial and skeletal abnormalities. In mice, inactivation of the homologous gene reproduces the human phenotype, revealing a role for Trps1 in regulating chondrogenesis. The Trps1 protein is a transcription factor with nine predicted zincfinger (zf) domains. Previous in vitro studies have shown that Trps1 interacts with Gli3, Hdac4 and Runx2, main transcriptional regulators of chondrocyte proliferation and differentiation. Based on these results, we hypothesize that first the Trps1 zf domains mediate binding with further, yet unidentified, interacting partners and second Trps1 functions as an adaptor in multiprotein complexes. To specify the molecular mechanism of Trps1 function, coimmunoprecipitations (Co-IPs) were performed. While the chondrogenic regulators Mef2c, Sin3a and Sox9 did not bind to Trps1, the heat shock protein Hsp90β and the histonedeacetylase Hdac1 were found as new Trps1- interacting partners. In contrast, no interaction was observed with Hdac2, the closest homolog of Hdac1, although both Hdacs are expressed in all chondrocytes and are known to be part of the same complexes. For Trps1 and Hdac1, the interacting domains were mapped to a region encompassing the GATA- and IKAROS-zfs of Trps1 and the deacetylas e domain of Hdac1. Although this domain is present in all Hdac proteins, only Trps1- interacting Hdacs 1, 4 and 6 have sumoylation sites. The function of this sumoylation in Trps1-Hdac1 interaction has to be analysed in further experiments. As Trps1 GATA-and IKAROS-zfs mediate the interaction with Hdac1 as well as Runx2, a multiprotein complex formation appears possible. This multiprotein complex formation is supported by FRET experiments showing no direct interaction between Trps1 and Hdac1, indicating that they are connected via other proteins. To analyze complex formation around Trps1, gelfiltrations were performed on lysates of ATDC-5 chondrogenic cells. Trps1 and its interacting partners were detected in protein complexes >150 kDa. After isolating Trps1 complexes by Co-IPs, Hdac4, Hdac1 and Hsp90β were present in complexes >500 kDa. Beyond that, changes in Trps1 multiprotein complex composition during chondrogenesis were analysed in differentiated ATDC - 5 cells. Trps1 protein amount declines during this process leading to a reduction of Trps1 complexes. Hdac1 and Hsp90β still interact with Trps1 in complexes >500 kDa, while the Hdac4 protein amount was insufficient to precipitate with Trps1. The aforementioned complex sizes strongly suggest the existence of further, yet unidentified, interacting partners. The identification of these proteins will contribute to a more detailed understanding of the mechanism regulating endochondral bone formation.

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Moll, Carina: Die Rolle von Trps1 in der Bildung von Transkriptonskomplexen und Chromatinorganisation. 2017.

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