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Untersuchung des Einflusses von Rab-GTPasen und Endozytose-Inhibitoren auf die Zellbiologie und Zellschicksalsspezifikation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Ludwig, Anna-Kristin

Ein wichtiger Aspekt der Stammzellbiologie ist es zu verstehen, welche Mechanismen an der Zellschicksalsentscheidung Selbsterhalt oder Differenzierung von Stammzellen beteiligt sind. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSVZ) in der Lage sind sich asymmetrisch zu teilen (Beckmann et al., 2007). Dabei segregierten drei Proteine die mit Endosomen assoziiert waren asymmetrisch in die Tochterzellen, was zu der Vermutung führte, dass eine Verbindung zwischen der endosomalen Maschinerie und Zellschicksalsentscheidungen von HSVZ besteht. Rab-GTPasen sind Hauptregulatoren endosomaler Transportwege und endozytotische Prozesse lassen sich durch verschiedene Inhibitoren blockieren. Durch ektope Expression von wildtypischen, konstitutiv-aktiven und dominant-negativen Varianten von Rab5, Rab7, Rab11 und Rab21 wurde der Einfluss endosomaler Transportwege auf die Zellbiologie und Zellschicksalsspezifikation von HSVZ untersucht. Zusätzlich zu der genetischen Manipulation der endosomalen Wege, wurde die Wirkung von Endozytoseinhibitoren auf die Zellbiologie und das Zellschicksal analysiert. Ähnlich wie in anderen zellulären Systemen führte die Expression der Rab-GTPase Varianten (WT, DN und CA) zu teils drastischen Veränderungen der subzellulären Organisation von endosomalen Kompartimenten. Vor allem zeigte die Expression von Rab5CA eine abnormale Vergrößerung der Endosomen und Reorganisation von späten endosomalen Markerproteinen. Darüber hinaus, zeigte die Expression von Rab11DN eine Verminderung der Ausbildung morphologisch polarisierter CD34+ Zellen. Eine Beeinträchtigung der Motilität durch Rab11DN oder eine andere Rab-GTPase-Variante war nicht erkennbar. Die Behandlung mit Endozytose-Inhibitoren resultierte in einer gestörten Endozytose von Rezeptorliganden und verhinderte teilweise die Ausbildung und den Erhalt der Zellpolarität von CD34+ Zellen. Funktionelle Analysen von genetisch und pharmazeutisch manipulierten CD34+ Zellen in CFC-Ansätzen zeigten, dass endosmale Prozesse, die durch Rab5WT, Rab5DN, Rab7DN und Rab21DN sowie die Inhibitoren Dynasore, MβCD und Spautin-1 verändert werden, das erythrozytäre-myeloische Linienpotenzial der CD34+ Zellen beeinflussen. Rab5DN und Rab21DN sowie Dynasore, MβCD und Spautin-1 verminderten die Bildung von Makrophagen (CFU-G bzw. CFU-GM), Granulozyten (CFU-G bzw. CFU-GM) und Erythrozyten enthaltenen Kolonien (BFU-E und CFU-Mix). Die Effekte von Rab5DN und Rab21DN auf die spezifischen Kolonietypen fanden sich in beiden analysierten Zellpopulationen (CD133+CD34+ und CD133lowCD34+) der CD34+Zellen und verminderten zudem das gesamte Koloniebildungspotenzial der Zellen. Rab5WT und Rab7DN förderten die Bildung von erythrozytären Kolonien (BFU-E und CFU-Mix) innerhalb der CD133lowCD34+ Zellpopulation. Durch die Verwendung von erythrozytären und megakaryozytären Differenzierungsverfahren konnten die fördernden Effekte von Rab5WT und Rab7DN auf die erythrozytäre und megakaryozytäre Differenzierung von CD133lowCD34+ Zellen bestätigt werden.

An important aspect of stem cell biology is to understand the mechanisms controlling the decision of self-renewal versus differentiation. Previously, we confirmed the long lasting conjecture that human hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) have the capability to divide asymmetrically. In our studies we demonstrated that in a proportion of dividing HSPCs endosomal proteins segregate differently into arising daughter cells, pointing towards a relationship between organization of the endosomal compartment and cell fate specification processes in HSPCs. Rab-GTPases are key regulators of endosomal trafficking and endocytic pathways can be interfered with different inhibitors. By means of ectopic expression, we analyzed the impacts of wild type (WT), constitutive active (CA) and dominant-negative (DN) Rab5, Rab7, Rab11 and Rab21 variants on the development of human HSPCs (umbilical cord blood (UCB) derived CD34+ cells). In addition impacts of different endocytic inhibitors were investigate on cell fate specification of HSPCs. According to other cellular systems expression of Rab-GTPase variants (WT, DN and CA) was found to interfere partly drastically with the organization of the endosomal compartment. Especially, Rab5CA expression resulted in the formation of giant endosomes, which contain early as well as late endosomal marker proteins. In addition, expression of Rab11DN results in a reduction of the formation of polarized migration phenotypes. However, we did not recognize any impact on cell motility by this or any other analyzed Rab-GTPases. Treatment of CD34+ cells with endocytic inhibitors result in impaired endocytosis of receptor ligands and affected establishment and maintenance of cell polarization. In contrast, CFC-assays revealed impacts of Rab5WT, Rab5DN, Rab7DN and Rab21DN as well as of the inhibitors Dynasore, MβCD and Spautin-1 on the erythro-myeloid lineage potential of CD34+ cells. Here, Rab5DN and Rab21DN as well as Dynasore, MβCD and Spautin-1 impaired colony formation potential of Macrophage (CFU-G/CFU-GM), granulocytic (CFU-G/CFU-GM) and erythroid colonies (BFU-E and CFU-Mix). Effects of Rab5DN and Rab21DN on the different colony types were detected in both analyzed cell populations (CD133+CD34+ und CD133lowCD34+) of CD34+ cells and decreased the total colony formation potential of the cells. Rab5WT and Rab7DN enhance erythroid colony formation (BFU-E und CFU-Mix). Using special erythroid and megakaryocytic read out systems, we confirmed that Rab5WT and Rab7DN promote erythroid and megakaryocytic lineage differentiation.

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Ludwig, Anna-Kristin: Untersuchung des Einflusses von Rab-GTPasen und Endozytose-Inhibitoren auf die Zellbiologie und Zellschicksalsspezifikation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. 2014.

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