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Influence of the hepatitis C genotype on the antiviral immune response

Skibbe, Kathrin Nina

Transmission of hepatitis C virus (HCV) is closely linked to blood-blood contact. Accordingly, in developed countries HCV is mainly acquired by people who inject drugs (PWID). Importantly, PWID living in Germany are frequently exposed to different HCV genotypes (GTs) with GT1 and GT3 being predominant. As the infecting genotype can influence the infection outcome and HCV-specific CD8+ T cells play a major role in the immune response against HCV, we wanted to investigate the influence of the viral GT on the antiviral CD8+ T cell response in more detail in highly exposed individuals. For this purpose we worked with a cohort of 363 PWID from Essen, Germany that consisted of patients that remained seronegative for HCV (11%), patients with spontaneously resolved HCV infection (25%) and chronically infected patients (33% GT1, 27% GT3 and 4% other GTs). As a first step, we examined two host genetic factors that have been implicated with affecting HCV infection outcome. Single nucleotide polymorphisms near the IFNL3 gene have been associated with spontaneous clearance and enhanced response to therapy. In our cohort the “protective” IFNL3 rs12979860 C/C GT was significantly less frequent in GT1 infected patients compared to patients with resolved HCV infection, while subjects infected with GT3 showed an intermediate GT frequency. No significant differences in the CD8+ T cell response depending on the IFNL3 GT were detected, suggesting that the protective effect mediated by the IFNL3 C/C GT is independent of the CD8+ T cell response. Next, the impact of the HLA class I genotype on infection outcome was determined. In this cohort HLA-B*08 was a risk allele for GT1 infection, whereas HLA-B*27 was protective against both GT1 and GT3 infection. This second finding was unexpected, as HLA-B*27 was so far only described to protect against GT1 due to sequence differences in the immunodominant CD8+ T cell epitope NS5B2841 between both genotypes. We therefore aimed to identify novel GT3-specific CD8+ T cell responses that might mediate the protective effect. By screening predicted HLA-B*27-binders we identified the two novel epitopes, NS2840 GRLIWWNQY and NS2942 GRWFNTYLY, with the latter one being immunodominant in GT3. The strength of the CD8+ T cell response to the immunodominant GT3-specific B*27-epitope was comparable to the response against the known GT1-specific NS5B2841 epitope. Viral sequence analysis of the NS2 epitope regions provided evidence for mutational escape in HLA-B*27-positive patients in the NS2942 epitope. In summary, different epitope repertoires could be detected in GT1 and GT3 infected patients indicating that different CD8+ T cell responses contribute to the protective effect of HLA-B*27. Genotype-specific differences in the elicited CD8+ T cell response can also play an important role in determining the outcome of HCV infection. Our group has previously shown that patients with CD8+ T cells active against both GT1 and GT3 are predominantly found in PWID with resolved infection. Here, we tested if distinct CD8+ T cell responses against different sequence variants of the same epitope can be activated in patients exposed to different genotypes. The analysis was focused on immunodominant epitopes presented by HLA class I alleles that have been described in the context of immune control of viral infections (HLA-B*13, HLA-B*15, HLA-B*27 and HLA-B*57). Distinct responses against two GT-specific variants were found for 4 out of 5 tested epitopes, while one epitope was cross-reactive between all tested GT variants. Analysis of the T cell receptor (TCR) Vβ chain repertoire confirmed in most cases that distinct CD8+ T cell populations were activated by the different variants. As a proof of principle, priming against two different GT-specific variants of the same epitope is therefore possible within one patient, suggesting that inclusion of different sequence variants of important epitopes in a prophylactic vaccine may be feasible. As a last factor influencing the outcome of HCV infection in different genotypes we looked at the deletion of HCV-specific CD8+ T cells, as a rapid loss of specific T cells is observed upon viral persistence and continuous antigen exposure. We confirmed lower frequencies of HCV-specific CD8+ T cells in chronically infected patients compared to patients with resolved infection. It was tested whether the pro-apoptotic protein Bim is involved in CD8+ T cell depletion in HCV, as it was reported that activation of T cells in the liver of mice and in human HBV infection leads to upregulation of Bim. In contrast to HBV, Bim was not differentially regulated in CD8+ T cells from patients with resolved or chronic HCV infection ex vivo. Upon antigen-specific activation Bim and CD38 were both upregulated irrespective of the disease status. Taken together, our data suggest that dysregulation of Bim does not seem to contribute to CD8+ T cell depletion during chronic HCV infection.

Die Übertragung von Hepatitis C Virus (HCV) geschieht hauptsächlich über Blutkontakt, so dass intravenöse Drogengebraucher („people who inject drugs”, PWID) die Hauptrisikogruppe für HCV Infektionen in entwickelten Ländern darstellen. PWID in Deutschland sind häufig unterschiedlichen HCV Genotypen (GT) ausgesetzt, wobei GT1 und GT3 am weitesten verbreitet sind. Da der infizierende Genotyp den Ausgang der Infektion beeinflussen kann und HCV-spezifische CD8+ T Zellen eine wichtige Rolle bei der Immunantwort gegen HCV spielen, wollten wir im Detail untersuchen, welchen Einfluss der virale Genotyp auf die antivirale CD8+ T Zellantwort in hochexponierten Individuen hat. Zu diesem Zweck wurde eine Kohorte von 363 PWID aus Essen, Deutschland untersucht, die aus seronegativen Patienten (11%), Patienten mit spontan ausgeheilter HCV Infektion (25%) und Patienten mit chronischer Infektion (33% GT1, 27% GT3 und 4% andere GT) bestand. Zunächst wurden zwei genetische Wirtsfaktoren analysiert, die Auswirkungen auf den Ausgang einer HCV Infektion haben können. Einzelne Nukleotidpolymorphismen nahe dem IFNL3 Gen wurden mit spontaner Ausheilung und besserem Ansprechen auf Therapie assoziiert. Verglichen mit Patienten mit ausgeheilter HCV Infektion kam der „protektive“ IFNL3 rs12979860 C/C GT in unserer Kohorte wesentlich weniger häufig in GT1 infizierten Patienten vor. Dahingegen hatten GT3 infizierte Patienten eine intermediäre GT Frequenz. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der CD8+ T Zellantwort abhängig vom IFNL3 GT gefunden. Dies deutet darauf hin, dass der protektive Effekt des IFNL3 C/C GT nicht durch die CD8+ T Zellantwort vermittelt wird. Als nächstes wurde der Einfluss des HLA Klasse I Genotypen auf den Ausgang der Infektion ermittelt. In unserer Kohorte war HLA-B*08 ein Risikoallel, wohingegen HLA-B*27 protektiv gegen sowohl GT1 als auch GT3 war. Diese zweite Beobachtung war unerwartet, da der protektive Effekt von HLA-B*27 bis jetzt nur für GT1 beschrieben worden war. Dies wurde auf Sequenzunterschiede zwischen den Genotypen in dem immundominanten CD8+ T Zellepitop NS5B2841 zurückgeführt. Daher wollten wir neue GT3-spezifische CD8+ T Zellantworten identifizieren, die diesen protektiven Effekt erklären könnten. Das Screening von vorausgesagten HLA-B*27 Bindern ergab zwei neue Epitope: NS2840 GRLIWWNQY and NS2942 GRWFNTYLY. Das NS2942 Epitop war immundomiant in GT3 und die Stärke der CD8+ T Zellantwort war vergleichbar mit dem bekannten GT1-spezifischen NS5B2841 Epitop. Virale Sequenzanalysen der NS2 Epitopregionen lieferten Beweise für Escapemutationen im NS2942 Epitop. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass verschiedene Epitoprepertoire in GT1 und GT3 infizierten Patienten vorhanden sind und daher verschiedene CD8+ T Zellen zu dem protektiven Effekt von HLA-B*27 beitragen. Genotyp-spezifische Unterschiede in der CD8+ T Zellantwort können den Ausgang einer HCV Infektion erheblich beeinflussen. Unsere Arbeitsgruppe hat bereits zuvor gezeigt, dass Patienten mit CD8+ T Zellantworten, die gegen GT1 und GT3 gerichtet sind, hauptsächlich in PWID mit ausgeheilter Infektion vorkommen. Daher wollten wir testen, ob Patienten, die verschiedenen Genotypen ausgesetzt sind, distinkte CD8+ T Zellantworten gegen verschiedene Sequenzvarianten desselben Epitops besitzen. Die Analyse wurde auf immundominante Epitope konzentriert, die von HLA Klasse I Molekülen präsentiert werden, die im Zusammenhang mit Immunkontrolle von Virusinfektionen beschrieben wurden (HLA-B*13, HLA-B*15, HLA-B*27 und HLA-B*57). Distinkte Antworten gegen zwei GT-spezifische Varianten wurden in 4 von 5 Fällen gefunden, während ein Epitop kreuzreaktiv zwischen den getesteten GT Varianten war. Eine Analyse des T Zellrezeptor Vβ Kettenrepertoires bestätigte, dass verschiedene Varianten in den meisten Fällen distinkte CD8+ T Zellpopulationen aktivieren. Dies zeigt, dass ein Priming gegen zwei verschiedene GT-spezifische Varianten desselben Epitops in einem Patienten möglich ist. Daher wäre die Aufnahme verschiedener Sequenzvarianten wichtiger Epitope in eine prophylaktische Vakzine sinnvoll. Als letzter Faktor, der den Ausgang einer HCV Infektion beeinflussen kann, wurde die Deletion von HCV-spezifischen CD8+ T Zellen untersucht, da ein rapider Verlust von spezifischen T Zellen bei viraler Persistenz und kontinuierlicher Antigenaussetzung beobachtet wird. Wir konnten niedrigere Frequenzen von HCV-spezifischen CD8+ T Zellen in chronisch infizierten PWID bestätigen. Es wurde untersucht, ob das pro-apoptotische Protein Bim eine Rolle bei der Deletion von CD8+ T Zellen während der HCV Infektion spielt, da die Aktivierung von T Zellen in der Leber von Mäusen und während der humanen HBV Infektion zu einer Hochregulierung von Bim führt. Im Gegensatz zu HBV war Bim in CD8+ T Zellen in chronischen HCV Patienten ex vivo nicht anders reguliert als in Patienten mit ausgeheilter Infektion. Nach Antigen-spezifischer Aktivierung waren sowohl Bim als auch der Aktivierungsmarker CD38 unabhängig vom Infektionsausgang hochreguliert. Zusammengenommen weisen unsere Daten darauf hin, dass während einer chronischen HCV Infektion die Dysregulation von Bim nicht zur Deletion von HCV-spezifischen CD8+ T Zellen beiträgt.

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Skibbe, Kathrin Nina: Influence of the hepatitis C genotype on the antiviral immune response. 2014.

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