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Relevance of survivin acetylation for its biological function

Unruhe, Britta LSF

Survivin belongs to the inhibitor of apoptosis protein family and is also a regulator of mitosis as it is a member of the chromosomal passenger complex (CPC). While it is not expressed in differentiated adult tissue (Adida et al., 1998), it was found to be upregulated in virtually all types of human cancers (Ambrosini et al., 1997; Adida et al.,2000). Its overexpression is associated with resistance of tumors against chemo- and radiotherapy, frequent recurrences and decreased patient survival (Engels et al., 2007; Capalbo et al., 2007; Xu et al., 2014; Chen et al., 2014). Thus, Survivin is a potential target for cancer therapy. In order to develop strategies for the therapeutic inhibition of Survivin, the mechanisms underlying its dual role have to be clarified in detail. While Survivin fulfills some of its cellular tasks as a homodimer (Pavlyukov et al., 2011), other functions require the monomer (Jeyaprakash et al., 2007). A further layer of complexity is introduced by the fact that Survivin shuttles between the nucleus and the cytoplasm as it is able to passively diffuse into the nucleus and is actively exported by the solublereceptor CRM1 (Rodriguez et al., 2002; Knauer et al., 2006). The mechanisms regulating Survivin’s functions, its localization as well as its dimerization state are still not completely resolved and a matter of scientific disagreement. Recently, Wang et al. (2010b) reported that acetylation of Survivin at lysine 129 facilitates its dimerization, thus causing an accumulation of the protein in the nucleus as only the monomer is able to interact with CRM1 for nuclear export. As lysine acetylation has emerged as a major post-translational modification capable of altering the functions and interactions of proteins, it is conceivable that Survivin’s function might be regulated by the acetylation of any of its 16 lysine residues. Thus, as a preliminary work to our study, which aimed to identify further acetylation sites in Survivin and the effect of a potential acetylation on some of Survivin’s functions, we first set out to verify the findings obtained by Wang et al. (2010b). Accordingly, we cloned the four SurvK129 mutants investigated in their study and characterized them performing comprehensive molecular and structural analyses. Wang et al. (2010b) reported a facilitated nuclear export and a reduced tendency to form dimers for the SurvK129E mutant, which they refered to as a mimicking mutant for Survivin unmodified at K129. They also claimed that this mutant was comparable to the SurvK129R mutant bearing a lysine to arginine mutation typically introduced to mimic an unmodified lysine. In contrast to their results, we found that SurvK129E is unique among the analyzed SurvK129 mutants and not comparable to SurvK129R. Taken together, our results suggest that the effects observed for SurvK129E are not caused by the lack of acetylation at K129, but might be due to the emergence of a potential high-affinity export signal by the exchange of a positively charged lysine with a negatively charged glutamate at position 129. Moreover, our findings indicate that acetylation of Survivin at K129 impairs dimerization rather than facilitating it. Furthermore, we wanted to find out whether Survivin acetylated at K129 is involved in mitosis. Our analyses indeed indicate that acetylated Survivin might be incorporated into the CPC. Finally, potential further acetylation sites within the Survivin protein were identified by in situ acetylation prediction. Fifteen Survivin mutants were cloned in which probably acetylated lysine residues were either mutated to arginine or to glutamine in order to mimic an unmodified or an acetylated lysine residue. These mutants were analyzed accordingly to the SurvK129 mutants in order to reveal potential effects on Survivin’s cellular and mitotic localization as well as on its dimerization. However, the characterization of the mutants could not identify lysine residues potentially involved in Survivin regulation. Nevertheless, we could show that, although K90 is located within Survivin’s classical export signal, its acetylation is unlikely to affect the protein’s dimerization. In summary, our results indicate that further comprehensive studies are required in order to understand the complex regulation of Survivin’s various functions and the role that lysine acetylation plays in it.

Survivin gehört zur Proteinfamilie der Apoptose-Inhibitoren, ist aber als Mitglied des chromosomalen Passenger-Complexes (CPC) ebenso an der Regulation der Mitose beteiligt. Während es in differenziertem, adulten Gewebe nicht exprimiert wird (Adida et al., 1998), wurde eine Hochregulation in nahezu allen humanen Krebsarten nachgewiesen (Ambrosini et al., 1997; Adida et al., 2000). Seine Überexpression steht in Verbindung mit der Resistenz von Tumoren gegen Chemo- und Strahlentherapie, einem häufigen Wiederauftreten von Tumoren und einer verringerten Überlebenszeit der Patienten (Engels et al., 2007; Capalbo et al., 2007; Xu et al., 2014; Chen et al., 2014). Demzufolge stellt Survivin ein mögliches Angriffsziel für die Krebstherapie dar. Die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Inhibition von Survivin setzt jedoch ein grundlegendes Verständnis der molekularen Mechanismen, die seiner Doppelfunktion zugrunde liegen, voraus. Seine duale Rolle führt Survivin innerhalb der Zelle teilweise als Monomer, zum Teil aber auch als Homodimer aus. Survivin ist zudem in der Lage, zwischen Zellkern und Cytoplasma hin und her zu wandern, indem der durch den Exportrezeptor CRM1 vermittelte, aktive Export aus dem Kern der passiven Diffusion entgegenwirkt (Rodriguez et al., 2002; Knauer et al., 2006). Die Mechanismen, welche die Funktion, Lokalisation und Dimerisierung von Survivin regulieren, konnten bisher nicht vollständig aufgeklärt werden und sind Gegenstand kontroverser wissenschaftlicher Diskussionen. Einer Studie von Wang et al. (2010b) zufolge fördert die Acetylierung von Survivin an Lysin 129 dessen Dimerisierung. Dies führt zu einer Ansammlung des Proteins im Zellkern, da nur das Survivin-Monomer an den Exportrezeptor CRM1 binden kann. Da die Lysin-Acetylierung zudem als eine bedeutende post-translationale Modifikation gilt, welche die Funktionen und Interaktionen von Proteinen beeinflussen kann, ist eine Regulation von Survivin durch die Acetylierung einiger seiner 16 Lysin- Reste durchaus denkbar. Zunächst wurden zur Verifizierung der Ergebnisse von Wang et al. (2010b) die dort verwendeten vier SurvK129-Mutanten kloniert und mittels umfassender molekularer und struktureller Analysen charakterisiert. Wang et al. (2010b) beschreiben einen erleichterten Kernexport sowie eine verringerte Dimerisierungstendenz der SurvK129EMutante, welche in dieser Studie als an Lysin 129 nicht modifizierbar charakterisiert wird. Auch sei diese Mutante vergleichbar mit der SurvK129R-Mutante, die eine Lysinzu-Arginin-Mutation trägt, welche typischerweise zur Nachahmung eines unmodifizierten Lysins eingeführt wird. Im Gegensatz zu Wang et al. (2010b) konnten wir zeigen, dass SurvK129E einzigartig unter den betrachteten SurvK129-Mutanten und nicht vergleichbar mit SurvK129R ist. Insgesamt weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Effekte, die für die SurvK129E-Mutante beobachtet wurden, nicht durch die fehlende Acetylierung an K129, sondern durch die Entstehung eines möglichen Exportsignals mit einer hohen Affinität zu CRM1 hervorgerufen werden könnten. Die Erhöhung der Affinität des möglicherweise bestehenden, schwachen Exportsignals käme dabei durch den Austausch des positiv geladenen Lysins an Position 129 durch ein negativ geladenes Glutamat zustande. Darüberhinaus deuten unsere Erkenntnisse eher aufeine Beeinträchtigung als auf eine Begünstigung der Dimerisierung durch die Acetylierung an K129 hin. Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Rolle von acetyliertem Survivin in der Mitose deutete sich weiterhin an, dass im CPC gebundenes Survivin acetyliert vorliegen könnte. Weitere mögliche Acetylierungsstellen innerhalb von Survivin wurden durch eine in situ Acetylierungsvorhersage identifiziert. Darauf basierend wurden 15 Survivin-Mutanten kloniert, in welchen mit hoher Wahrscheinlichkeit acetylierte Lysin-Reste zu Arginin oder Glutamin mutiert wurden, um entweder ein unmodifiziertes oder ein acetyliertes Lysin zu imitieren. Diese Mutanten wurden analog zu den SurvK129-Mutanten analysiert, um mögliche Effekte auf die zelluläre und mitotische Lokalisation sowie die Dimerisierung von Survivin nachzuweisen. Anhand dieser Untersuchungen konnten allerdings keine Lysin-Reste identifiziert werden, welche eine tragende Rolle in dessen Regulation spielen. Allerdings ist davon auszugehen, dass eine Beeinträchtigung der Dimerisierung durch die Acetylierung von Lysin 90 unwahrscheinlich ist, obwohl sich dieses innerhalb des klassischen Exportsignals von Survivin befindet. Zusammenfassend implizieren unsere Ergebnisse, dass weitere umfassende Studien nötig sind, um die komplexe Regulation der verschiedenen Funktionen von Survivin und insbesondere die Rolle der Lysin-Acetylierung im Detail zu verstehen.

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Unruhe, Britta: Relevance of survivin acetylation for its biological function. 2017.

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