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Die Rolle der Rho-GTPase RhoA in der Transkriptionskontrolle der Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9) in U-2 OS Zellen

Müller, Olga

Die Rho-GTPase RhoA reguliert zusammen mit seinem Effektor ROCK1/2 die Generierung und Kontraktilität von Aktin-Stressfasern in einer Vielzahl von zellulären Bewegungsprozessen. So trägt die Aktivität von RhoA maßgeblich zum komplexen Zusammenspiel von Zellbewegung und invasivem Potential während der Tumorzellinvasion bei. Interessanterweise deuten vorangegangene Arbeiten darauf, dass RhoA ebenfalls in der Expressionskontrolle von Matrix Metalloproteinasen (MMPs), wie der Tumor-assoziierten MMP9, involviert ist. Die molekularen Mechanismen sind jedoch nur bruchstückhaft charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die Regulation der MMP9-Transkription durch den RhoA-ROCK-Signalweg in invasiven U-2 OS Zellen entschlüsselt werden. Die RNAi-vermittelte Depletion von RhoA sowie die Inhibition von ROCK1/2 führten zu einem starken Anstieg der MMP9-mRNA-Expression. Es konnte gezeigt werden, dass die direkten Effektoren von ROCK1/2, die Formine FHOD1 und mDia2, diesen Effekt vermitteln. In Reportergen-Analysen konnte zudem die Aktivierung der für die MMP9-Transkription wichtigen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-ºB in RhoA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Einzelzellanalysen zeigten neben der erhöhten MMP9-Transkription einen verstärkten Matrix-Abbau, der ebenfalls auf ein erhöhtes invasives Potential in diesem Kontext deutet. Insgesamt führten jedoch der substantielle Verlust der Zellpolarität und die verringerte zelluläre Dynamik nach RhoA-Depletion zu einer verringerten Invasion. Die verstärkte MMP9-Transkription nach Verlust des RhoA-ROCK-Formin-Signalweges deutet darauf, dass die Signalkaskade für die Repression der MMP9-Expression und somit für ein geringes Invasionspotential wichtig ist. Interessanterweise führte die pharmakologische Auflösung von zellulärem F-Aktin zu einer starken Erhöhung der MMP9-mRNA-Menge, was die kontrollierte Dynamik des Aktinzytoskeletts als potentielle Regulationsebene in der MMP9-Transkription in den Vordergrund rückt. Des Weiteren wurde auf der Grundlage einer Genom-weiten Expressionsstudie, sowie dem Einsatz eines pharmakologischen Inhibitors und Western-Blot-Analysen gezeigt, dass die MAPKK MEK 1/2 und die MAPK ERK in RhoA-depletierten Zellen verstärkt aktiviert werden und als putative Aktivatoren von AP-1 und NF-ºB die MMP9-Transkription vorantreiben. Zusammenfassend zeigen diese Daten einen neuen Mechanismus zur Repression der MMP9-Transkription in migrierenden Zellen durch die RhoA-ROCK-Formin-Kaskade und bieten, mit dem dynamischen Aktinzytoskelett als potentielle Schnittstelle, wichtige Ansatzpunkte zur Entschlüsselung des inhibitorischen Zusammenspiels mit dem MEK-ERK-Signalweg.

The Rho GTPase RhoA via its effector ROCK1/2 regulates the formation and contractility of actin stress fibers in numerous dynamic cellular processes. In particular, during tumor cell invasion the controlled activation of this pathway is critical for the complex interplay between cell motility and invasive potential. Previous studies suggest that the GTPase also might control the transcription of various Matrix Metalloproteinases (MMPs) such as the invasion-related MMP9. However, the underlying molecular mechanisms are still not well understood. The aim of the present study was to gain novel insight into regulatory pathways mediating the transcriptional control of MMP9 downstream of the RhoA-ROCK pathway. Both, RNAi-mediated depletion of endogenous RhoA as well as the inhibition of ROCK1/2 lead to a strong increase of MMP9 mRNA expression in invasive human osteosarcoma (U-2 OS) cells. The ROCK effectors FHOD1 and mDia2, both members of the diaphanous-related formin family, were shown to mediate this effect. Reporter Gene Assays in RhoA-depleted cells revealed increased activity of the transcription factors AP-1 and NF-ºB, which are known to drive the transcription of MMP9. In addition to the increase of the MMP9 mRNA transcript, single cell experiments revealed enhanced matrix degradation by cells lacking RhoA further suggesting elevated invasive potential. However, despite these effects the substantial loss of cell polarity as well as the decreased overall cellular dynamics upon RhoA depletion resulted in impaired invasion into matrigel. The increased MMP9 transcription upon loss of RhoA-ROCK-Formin signaling suggests an inhibitory role for this pathway to repress MMP9 expression in order to maintain a decreased invasive potential. Interestingly, treatment with pharmacological inhibitors of actin polymerization to induce break-down of F-actin structures lead to a strong increase in MMP9 transcription indicating a regulatory platform by the dynamic reorganization of the actin cytoskeleton. Furthermore, genome-wide expression studies together with pharmacological inhibitor application and western blot analysis revealed that MEK1/2 and ERK were activated upon RhoA depletion and, potentially via AP-1 and NF-ºB, mediate the enhanced MMP9 transcription in this context. Together, this work presents a novel mechanism for repressing MMP9 transcription by RhoA-ROCK-Formin signaling in migratory cells and with the actin cytoskeleton as interface, provides a starting point for further characterization of the antagonistic cross-talk with the MAPK-pathway.

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Müller, Olga: Die Rolle der Rho-GTPase RhoA in der Transkriptionskontrolle der Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9) in U-2 OS Zellen. 2016.

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